تصنيع مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا المشتقة من الفئران
Summary
تحمل مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) تطبيقات واعدة في مجال هندسة أنسجة الكبد. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تحضير DSM للفئران ، والتي تشمل حصاد طحال الفئران ، وإزالة الخلايا منها من خلال التروية ، وتقييم DSM الناتج لتأكيد خصائصه.
Abstract
زراعة الكبد هي العلاج الأساسي لمرض الكبد في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن النقص وعدم كفاية جودة الأعضاء المانحة يستلزمان تطوير علاجات بديلة. ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة. ومع ذلك ، لا يزال الحصول على DLMs المناسبة يمثل تحديا. تم استكشاف استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs ، مما يوفر بديلا متاحا بسهولة. في هذه الدراسة ، تم حصاد طحال الفئران وإزالة الخلايا باستخدام مزيج من دورات التجميد والذوبان والتروية مع كواشف إزالة الخلايا. حافظ البروتوكول على البنى المجهرية ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل DSM. استغرقت عملية إزالة الخلايا الكاملة حوالي 11 ساعة ، مما أدى إلى وجود ECM سليم داخل DSM. أكد التحليل النسيجي إزالة المكونات الخلوية مع الاحتفاظ بهيكل ECM وتكوينه. يوفر البروتوكول المقدم طريقة شاملة للحصول على DSM ، ويقدم تطبيقات محتملة في هندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. تساهم هذه النتائج في تطوير مناهج بديلة لعلاج مرض الكبد في المرحلة النهائية.
Introduction
لا يزال زرع الكبد هو العلاج النهائي الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية1،2،3. ومع ذلك ، فإن النقص الحاد وانخفاض جودة الأعضاء المانحة قد زاد من الحاجة إلى علاجات بديلة4. في مجال الطب التجديدي ، ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة5،6،7. يحافظ DLM على بنية الكبد الأصلية ، بما في ذلك شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المعقدة ومكونات ECM ، مما يوفر سقالة لإنشاء BALs قابلة للزرع يمكن أن تخفف من أمراض الكبد.
على الرغم من الوعد ، فإن اعتماد هذه التكنولوجيا يواجه تحديات ، لا سيما في الحصول على DLMs المناسبة. هناك نقص في DLMs المشتقة من الإنسان ، في حين أن تلك من مصادر حيوانية تحمل مخاطر انتقال المرض والرفض المناعي. في نهج مبتكر ، استكشف بحثنا استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs8،9،10،11. يتوفر الطحال بسهولة أكبر في حالات طبية مختلفة ، مثل ارتفاع ضغط الدم البابي ، والتمزق الرضحي ، ورفرية نقص الصفيحات مجهول السبب ، والتبرع بعد الموت القلبي. لذلك ، الطحال متاح على نطاق أوسع من الكبد لأغراض البحث. المرضى الذين خضعوا لاستئصال الطحال لا يعانون من حالات قاسية ، مما يؤكد بشكل أكبر إمكانية الاستغناء عن الطحال. البيئة المكروية للطحال ، وخاصة المصفوفة خارج الخلية والجيوب الأنفية ، تشبه تلك الموجودة في الكبد. هذا يجعل الطحال عضوا مناسبا لالتصاق الخلايا وانتشارها في أبحاث زراعة خلايا الكبد. بناء على هذه النتائج ، أظهرت تحقيقاتنا السابقة أن DSMs تشترك في الهياكل المجهرية والمكونات المماثلة مع DLMs ويمكن أن تدعم بقاء ووظيفة خلايا الكبد ، بما في ذلك إنتاج الألبومين واليوريا. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن DSMs تعزز التمايز الكبدي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، مما يؤدي إلى تحسين الوظائف واتساقها.
من خلال استخدام DSMs المعالجة بالهيبارين ، قمنا بتصميم BALs وظيفية قادرة على إظهار منع تخثر الدم الفعال على المدى القصير والتعويض الجزئي لوظائف الكبد11. وبالتالي ، فإن هذا الدليل التشخيصي والإحصائي للاضطرابات النفسية ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا للنهوض بهندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. في هذا العمل ، نقدم الطرق التفصيلية لحصاد طحال الفئران وإعداد DSM التي تحافظ على الهياكل المجهرية ومكونات ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل BALs نهجا فعالا لعلاج أمراض الكبد في المرحلة النهائية ، لا سيما في الحالات التي يعوق فيها زرع الكبد النقص الحالي في الأعضاء المانحة6. خيار واعد لإنشاء BALs هو استخدام DLM ، الذي يحافظ على ECM الطبيعي للكبد الأصلي وهيكل الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن ندرة DLM البشري والمخاطر المحتم?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82000624) ، وبرنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (2022JQ-899 و 2021JM-268) ، وبرنامج دعم القدرة على الابتكار في مقاطعة شنشي (2023KJXX-030) ، والمشروع المشترك لجامعة خطة البحث والتطوير الرئيسية لمقاطعة شنشي – المشروع الرئيسي (2021GXLH-Z-047) ، والتأسيس المؤسسي لأول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ (2021HL-42 و 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
Referências
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
