Entwicklung eines klinisch relevanten hämorrhagischen Schockmodells bei Ratten

Summary

Jedes Jahr sterben weltweit 1,9 Millionen Menschen an einem hämorrhagischen Schock. Kleintiere werden häufig als hämorrhagische Schockmodelle verwendet, sind aber mit Fragen der Standardisierung, Reproduzierbarkeit und klinischen Bedeutung verbunden, was ihre Relevanz einschränkt. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung eines neuen klinisch relevanten hämorrhagischen Schockmodells bei Ratten.

Abstract

In den letzten Jahrzehnten hat uns die Entwicklung von Tiermodellen ermöglicht, verschiedene Pathologien besser zu verstehen und neue Behandlungen zu identifizieren. Der hämorrhagische Schock, d.h. das Organversagen durch den schnellen Verlust eines großen Blutvolumens, ist mit einer hochkomplexen Pathophysiologie verbunden, die mehrere Signalwege umfasst. Zahlreiche bestehende Tiermodelle des hämorrhagischen Schocks bemühen sich, das zu replizieren, was beim Menschen passiert, aber diese Modelle haben Grenzen in Bezug auf klinische Relevanz, Reproduzierbarkeit oder Standardisierung. Das Ziel dieser Studie war es, diese Modelle zu verfeinern, um ein neues Modell des hämorrhagischen Schocks zu entwickeln. Kurz gesagt, ein hämorrhagischer Schock wurde bei männlichen Wistar Han-Ratten (11-13 Wochen alt) durch eine kontrollierte Exsanguination induziert, die für einen Abfall des mittleren arteriellen Drucks verantwortlich war. Die nächste Phase von 75 Minuten bestand darin, einen niedrigen mittleren arteriellen Blutdruck zwischen 32 mmHg und 38 mmHg aufrechtzuerhalten, um die pathophysiologischen Wege des hämorrhagischen Schocks auszulösen. In der letzten Phase des Protokolls wurde die Patientenversorgung mit der Verabreichung von intravenösen Flüssigkeiten, Ringer-Laktat-Lösung, nachgeahmt, um den Blutdruck zu erhöhen. Laktat- und Verhaltenswerte wurden 16 Stunden nach Beginn des Protokolls bewertet, während hämodynamische Parameter und plasmatische Marker 24 Stunden nach der Verletzung ausgewertet wurden. Vierundzwanzig Stunden nach der Induktion des hämorrhagischen Schocks waren der mittlere arterielle und diastolische Blutdruck in der hämorrhagischen Schockgruppe gesenkt (p < 0,05). Herzfrequenz und systolischer Blutdruck blieben unverändert. Alle Marker für Organschäden waren mit dem hämorrhagischen Schock erhöht (p < 0,05). Die Laktämie- und Verhaltenswerte waren im Vergleich zur Scheingruppe erhöht (p < 0,05). Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das hier beschriebene Protokoll ein relevantes Modell des hämorrhagischen Schocks ist, das in nachfolgenden Studien verwendet werden kann, insbesondere um das therapeutische Potenzial neuer Moleküle zu bewerten.

Introduction

Der hämorrhagische Schock (HS) ist ein Schockzustand, der durch einen signifikanten Blutvolumenverlust gekennzeichnet ist, der zu Gewebedysoxie führt. HS ist eine komplexe Pathologie, die hämodynamische und metabolische Veränderungen mit pro- und antiinflammatorischen Reaktionen in Verbindung bringt. Jedes Jahr werden weltweit etwa 1,9 Millionen Todesfälle auf die Blutung und ihre Folgen zurückgeführt¹. Die aktuellen Leitlinien für die Versorgung umfassen in erster Linie die intravenöse Verabreichung von Flüssigkeit (ergänzt oder nicht mit vasoaktiven Molekülen) und die Sauerstofftherapie. Diese Behandlungen sind jedoch symptomatisch und können unwirksam sein, was erklärt, warum die HS-assoziierte Mortalität nach wie vor hoch ist². Dies rechtfertigt die Bedeutung der Identifizierung neuer molekularer und zellulärer Mechanismen und damit von Behandlungen zur Verringerung der Mortalität.

Tiermodelle ermöglichen es, die pathophysiologischen Mechanismen von Krankheiten zu entschlüsseln und neue Therapiestrategien zu testen. In der Literatur existieren zahlreiche Tiermodelle des hämorrhagischen Schocks. Diese Modelle unterscheiden sich nicht nur in den verwendeten Spezies, sondern auch in den Mitteln zur Induktion von HS (z. B. fester Druck vs. festes Volumen) (Tabelle 1, Tabelle 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Außerdem variieren die Protokolle innerhalb desselben Modelltyps (z. B. Zeitpunkt der Blutung, gezielter mittlerer arterieller Druck) (Tabelle 3)14,15,16,17,18,19,20. In Anbetracht der großen Vielfalt der bestehenden hämorrhagischen Schockmodelle und der Komplexität der Replikation der klinischen Situation bleibt die präklinische Erforschung dieser Pathologie begrenzt. Die Entwicklung eines reproduzierbaren, standardisierbaren und einfach zu implementierenden hämorrhagischen Schockmodells ist im Interesse aller. Dies würde den Vergleich zwischen den verschiedenen Studien erleichtern und so die komplexe Pathophysiologie des hämorrhagischen Schocks enträtseln. Das Ziel dieses Protokolls war es, ein neues klinisch relevantes Modell des hämorrhagischen Schocks bei Ratten zu entwickeln, wobei zwei aufeinanderfolgende Blutungsphasen mit festem Volumen gefolgt von einer festen Phase mit niedrigem Blutdruck verwendet wurden.

Tabelle 1: Spezies, die als Modell für den hämorrhagischen Schock verwendet wurden 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Die verschiedenen Arten des hämorrhagischen Schocks¹³. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Beispiel für die Vielfalt experimenteller Modelle des hämorrhagischen Schocks bei Ratten, der durch ein Protokoll mit festem Druck induziert wurde. Zusammenfassung der Parameter für verschiedene experimentelle Modelle des hämorrhagischen Schocks. Die rot dargestellten Gefäße sind Arterien, die blau dargestellten sind Venen. Für die Wiederbelebung wird das Volumen des entnommenen Blutes als Referenz verwendet (Blut: Wiederbelebung mit einem Volumen, das mit dem Volumen des während des Schocks entnommenen Blutes identisch ist; x2: Wiederbelebung mit einem Volumen, das doppelt so groß ist wie das während des Schocks entnommene Blut; x4: Wiederbelebung mit einem Volumen, das viermal so groß ist wie das während des Schocks entnommene Blut). MAP: Mittlerer arterieller Druck; RL: Ringer-Laktat 14,15,16,17,18,19,20. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der regionalen Ethikkommission (Protokoll (#17858 und #32499, CEEA-Pays de la Loire, Frankreich) gemäß der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union genehmigt und durchgeführt. Die Berichterstattung erfolgt in Übereinstimmung mit den aktuellen ARRIVE-Richtlinien und dem Leitfaden der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Pub. Nr. 85-23, überarbeitet 2011). 1. Ethischer Status und allgemeine Informationen über Ratten Männliche Wistar-Han-Ratten (Charles River, Saint-Germain-Nuelles, Frankreich) wurden im Alter von 10 Wochen an die Unité Thérapeutique Expérimentale abgegeben. Halten Sie die Ratten mindestens 1 Woche lang bei Standardtemperatur (21-24 °C), Luftfeuchtigkeit (40%-60%) und 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus mit einer Lichtperiode ab 07:30 Uhr. Stellen Sie Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung. Verwenden Sie für das Protokoll 11-13 Wochen alte Ratten mit einem Gewicht von 300-400 g. 2. Schritte zur Raumeinrichtung und -vorbereitung Schalten Sie die Anästhesiestation ein, stellen Sie die Heizmatte auf 37,5 °C ein und decken Sie sie mit einem unsterilen Tuch ab. Sterilisieren Sie die für das Protokoll erforderlichen chirurgischen Instrumente: DeBakey atraumatische Pinzette (1), feine und scharfe Schere oder Skalpell (1), Zange mit Standardmuster (2), Nadelhalter (1), Vannas Mikro-Präparierschere (1), Klemme (1). Bereiten Sie Katheter für die Halsvene und die Oberschenkelarterie vor.Für den Venenkatheter jugularis den Schlauch aus Polyethylen (PE50) auf eine 23-G-Nadel aufsetzen, wobei die Spitze am Ende abgeschnitten wird. Für den Katheter der Oberschenkelarterie bereiten Sie den in Schritt 2.3.1 beschriebenen Katheter vor und befestigen Sie einen PE10-Schlauch am Ende des PE50-Schlauchs. Bereiten Sie den Druckaufnehmer und die Katheter für die Oberschenkelarterie und die Halsvene vor, indem Sie sie mit stillatisierter Ringer-Lösung füllen, die bei 100 IE/ml heparinisiert ist. Platzieren Sie eine 2-ml-Spritze mit laktierter, mit 100 IE/ml heparinisierter Ringer-Lösung am Ende der Katheter und des Druckaufnehmers. Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen, da diese Signaldefekte verursachen. Schalten Sie die mit dem Druckmessumformer verbundene Software ein und kalibrieren Sie sie gemäß den Anweisungen des Lieferanten. 3. Vorbereitung der Ratte auf die Operation Betäuben Sie die Ratte mit einer Induktionsbox (Parameter: Sevofluran 8%, Luftdurchsatz: 1 L/min). Nach Überprüfung der Anästhesietiefe mittels Pedalreflex ist die Anästhesie bei Sevofluran 4 % und einem Luftdurchsatz von 0,6 l/min zu halten. Der präoperative Einsatz von Analgetika wurde aufgrund der hämodynamischen Wirkung dieser Moleküle vermieden.HINWEIS: In diesem Schritt wird die Anästhesietiefe alle 20 Minuten über den Pedalreflex beurteilt. Wiegen Sie die Ratte, legen Sie sie in der dorsalen Dekubitusposition auf eine Heizmatte und enthaaren Sie sie im Leisten- und Halsbereich. Desinfizieren Sie die enthaarten Stellen abwechselnd mit 10 % und 4 % Povidon-Jod-Lösungen (jeweils 3 Mal) mit unsterilen Mullkissen. Tragen Sie einen Tropfen Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Legen Sie die Ratte auf eine Heizmatte auf dem Operationstisch (dorsaler Dekubitus). Platzieren Sie die geschmierte Rektumsonde, um die Temperatur der Ratte zu kontrollieren. Halten Sie die Anästhesie bei Sevofluran 4 % mit einem Luftdurchsatz von 0,6 l/min. Tauschen Sie die Handschuhe gegen sterile Handschuhe aus, legen Sie das sterile Tuch auf die Ratte und schneiden Sie es an der Leisten- und Halsregion ein. 4. Kanülierung der Halsvene Lokalisieren Sie die Halswirbelsäule im unteren rechten Halsbereich, oberhalb des Schlüsselbeins, durch sichtbare Pulsation. Fassen Sie mit der atraumatischen Pinzette von DeBakey sanft die Haut und machen Sie dann mit einer feinen, scharfen Schere oder einem Skalpell einen präzisen Schnitt. Tragen Sie einen Tropfen Lokalanästhetikum (Lidocain 2%) auf die eingeschnittene Stelle auf. Schneiden Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette nach Standardmuster auf. Lokalisieren Sie die Halsvene und befreien Sie sie vorsichtig mit einer Standard-Pinzette aus ihrem Muskelkompartiment. Legen Sie einen 4/0-Seidenfaden an und ligieren Sie die distale Seite (zum Kopf hin) sicher. Verwenden Sie die Naht mit den Nadelhaltern, um die Halsvene zu spannen. Legen Sie eine 4/0-Naht auf der proximalen Seite (zum Herzen hin) und bereiten Sie einen chirurgischen Knoten vor, ohne ihn festzuziehen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Halsvene mit der Mikro-Präparierschere von Vannas. Nachdem Sie die Venenwand vorsichtig mit einer kleinen Pinzette gefasst haben, führen Sie den PE50-Katheter von Hand oder mit einer Standardpinzette in die Halsvene ein. Verwenden Sie in diesem Stadium ein steriles Mullkissen, um eventuelle Blutstropfen abzuwischen, die aus der Vene austreten können. Schieben Sie den Katheter leicht vor (0,5 cm) und überprüfen Sie seine korrekte Platzierung in der Vene, indem Sie eine kleine Menge Blut entnehmen und dann erneut injizieren (Blut in der Kanüle zeigt an, dass es sich in der Vene befindet). Ziehen Sie den zuvor vorbereiteten Knoten fest, um den Katheter zu sichern. Lassen Sie den Katheter an Ort und Stelle, befestigen Sie ihn an einer Spritze, die mit Laktat-Ringer-Lösung vorgefüllt ist, und bedecken Sie den eingeschnittenen Bereich mit einem angefeuchteten sterilen Mullkissen. 5. Kanülierung der Oberschenkelarterie Verwenden Sie die atraumatische Pinzette von DeBakey, um die Haut des Scarpa-Dreiecks des linken Beins zu greifen und mit einer feinen und scharfen Schere oder einem Skalpell einen Schnitt zu machen. Tragen Sie einen Tropfen Lokalanästhetikum (Lidocain 2%) auf die eingeschnittene Stelle auf. Dilatieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette mit Standardmuster. Lokalisieren Sie die Femurtrias (Arterie, Vene und Nerv). Führen Sie eine Pinzette unter die Triade und trennen Sie mit der zweiten Standardpinzette sehr vorsichtig die Arterie von der Nerven- und Oberschenkelvene.HINWEIS: Die Arterie ist kleiner, rosa und pulsierend. Dies ist ein entscheidender Schritt; Die Vene und die Arterie sind zerbrechlich und können leicht reißen. Legen Sie eine 4/0-Naht an und ligieren Sie die Oberschenkelarterie distal (Beinseite). Nehmen Sie die Naht mit den Nadelhaltern, um die Oberschenkelarterie in Spannung zu bringen. Legen Sie eine 4/0-Naht auf die proximale Seite (Herzseite) und bereiten Sie einen Knoten vor, ohne ihn zu schließen. Klemmen Sie die Arterie ein (platzieren Sie die Klemme stromaufwärts der proximalen Seitennaht). Die Oberschenkelarterie quer mit einer Mikropräparierschere von Vannas einschneiden (es sollte eine kleine Menge Blut aus der Arterie fließen). Fassen Sie mit einer Standardpinzette vorsichtig die Arterienwand und kanülieren Sie die Oberschenkelarterie mit dem Katheter (PE10-Ende) und halten Sie ihn mit einer Pinzette fest. Lösen Sie vorsichtig die Klemme, um nach Undichtigkeiten zu suchen, und überprüfen Sie dann das Drucksignal (bestätigt, dass sich der Katheter in der Oberschenkelarterie befindet) und prüfen Sie, ob kein Blut in den Katheter zurückfließt (Anzeichen einer Leckage an den Ventilen/Druckwandler). Wenn das Signal gut ist (erwartete Werte: systolischer Blutdruck: 120 mmHg, diastolischer Blutdruck: 80 mmHg) und keine Anzeichen einer Leckage vorhanden sind, schieben Sie den Katheter leicht vor (0,5 cm) und ziehen Sie den zuvor vorbereiteten Chirurgenknoten fest. Heparinisieren Sie das Tier bei 100 IE/kg und tragen Sie ein angefeuchtetes steriles Mullkissen auf die eingeschnittene Stelle auf. Nach der Operation ist die Anästhesie bei Sevofluran 3% bei einem Luftdurchsatz von 0,6 l/min zu halten. 6. Protokoll des hämorrhagischen Schocks (Abbildung 1) Phase 1: Stabilisierung (5 min).Warten Sie nach der Heparinisierung 10 Minuten, bis sich die Druckwerte stabilisiert haben. Machen Sie eine 5-minütige Aufzeichnung der basalen hämodynamischen Werte. Phase 2: Ausblutung (5 min):HINWEIS: Diese Phase entspricht der Phase mit festem Volumen des Modells.Entnahme von 5 ml Blut aus der Oberschenkelarterie über 5 min (500 μl/30 s) mit einer 1 ml-Spritze (erwartete Werte: systolischer Blutdruck: 45 mmHg, diastolischer Blutdruck: 30 mmHg). Bereiten Sie eine Mischung aus 50 % Laktations-Ringer-Lösung und 50 % gesammeltem Blut bei Raumtemperatur vor. Geben Sie die Mischung in eine 2-ml-Spritze und platzieren Sie sie am Ende der Jugularvenenkanüle. Phase 3: Hämorrhagischer Schock (75 min)HINWEIS: Diese Phase ist die Phase mit festem Druck des Modells.Halten Sie den mittleren arteriellen Druck bei durchschnittlich 35 mmHg. Wenn der mittlere arterielle Druck über oder gleich 38 mmHg liegt, entnehmen Sie 200 μl Blut über die Oberschenkelarterie (Mittelwert bei n = 12 Ratten: 10,2 ml). Wenn der mittlere arterielle Druck unter 32 mmHg fällt, injizieren Sie 200 μl eines Gemischs aus 50 % Blut und 50 % Laktation Ringer-Lösung über die Halsvene (Mittelwert bei n = 12 Ratten: 0,90 ml). Messen Sie das periphere Blutlaktat an einem Blutstropfen vom Ende des Schwanzes mit der Spitze einer Nadel (26 G) nach steriler Präparation des Schwanzes mit einem Mullkissen am Ende der hämorrhagischen Schockphase. Phase 4: Intravenöse Flüssigkeitswiederbelebung (20 min)Reanimation mit einer Ringer-Laktatlösung bei Raumtemperatur (RT) bei 10 ml/kg über 20 min (Flussrate von 10,5 mL/h für eine 350-g-Ratte) mit einer 20-ml-Spritze durch den Jugularkatheter mit einer Spritzenpumpe. 7. Ende der Operation und Genesung sowie postoperative Nachsorge Klemmen Sie die Halsvene und die Oberschenkelarterie ein und entfernen Sie den Katheter. Ligate-Gefäße. Vergewissern Sie sich genau, dass kein Blut austritt. Geben Sie einen Tropfen Lokalanästhetikum auf die eingeschnittenen Stellen. Nähen Sie die eingeschnittenen Bereiche mit subkutanen und kutanen Nähten mit sterilem 5-0-Nahtmaterial. Mit 10%iger Povidon-Jod-Lösung desinfizieren. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg, 0,3 ml/kg) subkutan mit einer 1-ml-Spritze und einer 26-g-Nadel. Warten Sie, bis die Ratte von der Narkose entwöhnt ist, während Sie die Temperatur überwachen. Wenn sie Anzeichen des Aufwachens zeigt (Vibrissen, Bewegungen der Pfoten), entfernen Sie die Rektalsode und legen Sie die Ratte in ihren Käfig auf eine Heizmatte. 10 Minuten später bringen Sie die Ratte in ihr Unterkunftszimmer zurück. Verabreichen Sie Buprenorphin subkutan (0,05 mg/kg, 0,3 ml/kg) alle 8 h. Bewerten Sie die Atemfrequenz, das Verhalten, die Temperatur und das Blutlaktat 16 Stunden nach der Induktion des hämorrhagischen Schocks, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Abbildung 1: Modell des gemischten hämorrhagischen Schocks bei Ratten. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 8. 24 h nach hämorrhagischer Schockinduktion Betäuben Sie das Tier wie in Schritt 3.1 beschrieben. Legen Sie das Tier auf den Operationstisch und führen Sie die Rektumsonde wie in Schritt 3.5 beschrieben ein. Bereiten Sie den Katheter für die Kanülierung der Halsschlagader vor, wie in den Schritten 2.3 und 2.4 für die Halsvene beschrieben. Verwenden Sie die atraumatische Pinzette von DeBakey, um die Haut zu greifen und mit einer feinen und scharfen Schere oder einem Skalpell einen Schnitt in der Mitte des Halses zu machen. Tragen Sie einen Tropfen Lokalanästhetikum (Lidocain 2%) auf. Dilatieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette mit Standardmuster. Trennen Sie die Speicheldrüsen und öffnen Sie dann den Trachealmuskel, um die Trachealringe freizulegen. Nehmen Sie die linke Halsschlagader und trennen Sie sie mit einer Standardzange vom Nerv (es ist sehr wahrscheinlich, dass sich die Atmung des Tieres beschleunigt). Die Halsschlagader distal (Kopfseite) mit einem 4/0 Seidenfaden verzahnen. Legen Sie einen Nahtfaden auf die proximale Seite (Herzseite) und bereiten Sie einen chirurgischen Knoten vor, ohne ihn zu schließen. Klemmen Sie die Arterie ein (platzieren Sie die Klemme stromaufwärts der proximalen Seitennaht). Die Halsschlagader mit einer Mikropräparierschere von Vannas einschneiden (es sollte eine kleine Menge Blut aus der Arterie fließen). Fassen Sie mit einer Zange nach Standardmuster vorsichtig die Arterienwand, um die Öffnung zu vergrößern, und kanülieren Sie die Halsschlagader mit dem mitgelieferten Katheter und halten Sie sie mit einer Pinzette fest. Lösen und überprüfen Sie das Drucksignal, um die Platzierung des Katheters zu bestätigen, und vergewissern Sie sich, dass kein Blut in den Katheter zurückfließt (ein Zeichen für eine Leckage an den Ventilen/Druckwandlern). Wenn das Signal gut ist und keine Leckage vorliegt, schieben Sie den Katheter leicht vor (0,5 cm) und ziehen Sie den zuvor vorbereiteten Chirurgenknoten fest und sichern Sie ihn. Heparinisieren Sie das Tier bei 100 IE/kg und legen Sie eine angefeuchtete sterile Kompresse über den Schnitt. Nach der Operation ist die Anästhesie mit Sevofluran 3% bei einem Luftdurchsatz von 0,6 l/min aufrechtzuerhalten. Warten Sie 10 Minuten, um 24 h hämodynamische Werte aufzuzeichnen (erwartete Werte: systolischer Blutdruck: 120 mmHg, diastolischer Blutdruck: 60 mmHg). Um plasmatische Marker für Organschäden zu beurteilen, entnehmen Sie 1 ml Blut aus der Halsschlagader und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1600 x g . Aliquotieren und Plasma für die weitere Analyse aufbewahren. Die Ratte sofort nach der Messung der hämodynamischen Werte nach 24 h töten und Blut entnehmen.HINWEIS: Die Methode der Euthanasie sollte an die spezifischen Parameter oder Proben angepasst werden, die danach entnommen werden. Die Scheingruppe wird nur operiert (Sektionen 1-5, 7 und 8) ohne das Verfahren des hämorrhagischen Schocks (Sektion 6). Die Tiere wurden vom Versuchsleiter nach dem Zufallsprinzip zwischen der Schein- und der hämorrhagischen Schockgruppe eingeteilt. Nur der Experimentator wusste um die Gruppeneinteilung in den verschiedenen Stadien des Experiments.

Representative Results

In Anlehnung an das oben beschriebene Protokoll untersuchten wir 24 Stunden nach der Induktion des hämorrhagischen Schocks mehrere hämodynamische Parameter. Der basale mittlere arterielle Druck (vor Beginn des hämorrhagischen Schockprotokolls) ist zwischen der Schein- und der hämorrhagischen Schockgruppe ähnlich (Abbildung 2A). Erwartungsgemäß ist der mittlere arterielle Druck mit dem hämorrhagischen Schockprotokoll signifikant gesenkt, was durch den Abfall des diastolischen Blutdrucks erklärt werden kann (Mittlerer arterieller Druck: Schein: 92 mmHg ± 3 mmHg; HS: 82 mmHg ± 2 mmHg; Diastolischer Blutdruck: 73 mmHg ± 3 mmHg; HS: 61 mmHg ± 2 mmHg) (Abbildung 2B, C). Ein hämorrhagischer Schock hat keinen Einfluss auf den systolischen Blutdruck, den Pulsdruck und die Herzfrequenz (Abbildung 2D-F). Der Schockindex (Herzfrequenz/systolisches Blutdruckverhältnis) und der modifizierte Schockindex (MSI) (Herzfrequenz/mittleres Blutdruckverhältnis) sind zwei Prädiktoren für die Mortalität bei schweren Patienten14,15. Je höher die Werte sind, desto größer ist das Sterberisiko. In diesem Modell ist der Schockindex zwischen den beiden Gruppen unverändert, während der modifizierte Schockindex beim hämorrhagischen Schock tendenziell zunimmt (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; HS: 4,70 ± 0,15) (Abbildung 2G,H). Abbildung 2: Einfluss des hämorrhagischen Schocks auf hämodynamische Parameter. (A) Basaler mittlerer arterieller Druck, (B) mittlerer arterieller Druck, (C) diastolischer Blutdruck, (D) systolischer Blutdruck, (E) Pulsdruck, (F) Herzfrequenz, (G) Schockindex und (H) modifizierter Schockindex zwischen Schein- und hämorrhagischen Schocktieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mittels ungepaartem t-Test bewertet. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Die globale metabolische Beeinträchtigung während eines hämorrhagischen Schocks kann durch Lakttatämie beurteilt werden. Erwartungsgemäß stieg die Laktämie nach dem hämorrhagischen Schockprotokoll und 16 Stunden nach (Ende des Protokolls: Schein: 1,13 mmol/L ± 0,14 mmol/L; HS: 5,98 mmol/L ± 0,39 mmol/L; H+16: Schein: 1,95 mmol/L ± 0,23 mmol/L; HS: 2,95 mmol/L ± 0,19 mmol/L) (Abbildung 3A,B). Temperatur und Atemfrequenz sind zwei Komponenten des systemischen Entzündungsreaktionssyndroms (SIRS), einer proinflammatorischen Reaktion, die für den Schockzustand charakteristisch ist. Weder die Temperatur noch die Atemfrequenz haben sich zwischen den beiden Gruppen 16 h nach der Induktion des hämorrhagischen Schocks verändert (Abbildung 3C,D). Wir untersuchten den Einfluss des hämorrhagischen Schocks auf einige Verhaltensparameter wie Haltung, Aktivität usw. (Ergänzungsdatei 1). Der Behavioral Score ist in der hämorrhagischen Schockgruppe 16 h nach dem Protokoll erhöht (Sham: 0,33 ± 0,21; HS: 2,27 ± 0,69) (Abbildung 3E). Abbildung 3: Einfluss des hämorrhagischen Schocks auf Laktatämie, Temperatur, Atemfrequenz und Verhaltenswert. (A) Laktämie am Ende des hämorrhagischen Schockprotokolls, (B) Laktämie, (C) Temperatur, (D) Atemfrequenz und (E) Verhaltensscore 16 Stunden nach hämorrhagischer Schockinduktion zwischen Schein- und hämorrhagischen Schocktieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mittels ungepaartem t-Test bewertet. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Der hämorrhagische Schock geht mit einer Organfunktionsstörung einher. Um zu bewerten, ob das Modell klinisch relevant sein könnte, untersuchten wir plasmatische Marker für Organverletzungen 24 Stunden nach dem Protokoll. Die Kreatininämie (Schein: 19,13 μmol/L ± 0,33 μmol/L; HS: 28,88 μmol/L ± 2,69 μmol/L), das kardiale Troponin T (Sham: 9,38 ng/L ± 1,87 ng/L; HS: 35,62 ng/L ± 2,28 ng/L) und die Aspartat- und Alanin-Aminotransferase (ASAT: Sham: 221 UI/L ± 48 UI/L; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Schein: 36 UI/L ± 4 UI/L; HS: 323 UI/L ± 13 UI/L), die Schäden an Niere, Herz und Leber widerspiegeln, sind mit dem hämorrhagischen Schock signifikant erhöht (Abbildung 4). Abbildung 4: Das hämorrhagische Schockmodell ist mit Organfunktionsstörungen assoziiert. (A) Kreatininämie, (B) kardiales Troponin T, (C) Aspartataminotransferase und (D) Alaninaminotransferase-Spiegel 24 h nach hämorrhagischer Schockinduktion zwischen Schein- und hämorrhagischen Schocktieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mittels ungepaartem t-Test bewertet. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Datei 1: Details zur Verhaltensbewertung Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

In dieser Arbeit haben wir zum ersten Mal ein repräsentatives Rattenmodell des hämorrhagischen Schocks beschrieben, das auf einer Mischung aus dem Modell mit festem Druck und festem Volumen basiert. Wir konnten zeigen, dass unser Modell 24 Stunden nach der Schockinduktion mit einer Veränderung der hämodynamischen Parameter und des Stoffwechsels verbunden ist.

Aufgrund seiner komplexen Pathophysiologie erfordert die Untersuchung des hämorrhagischen Schocks die Verwendung integrierter Tiermodelle. In der Tat können In-vitro-Ansätze nicht alle Signalwege nachahmen, die an dieser Krankheit beteiligt sind. Das Aufwecken der Tiere nach dem hämorrhagischen Schockprotokoll ist ein Schritt, der eine bessere Replikation der klinischen Situation gewährleistet. Aufgrund der Schwierigkeit, die mit dem Aufwecken der Tiere verbunden ist, haben nur sehr wenige Studien dieses Stadium berücksichtigt. Die seltenen Studien, die Tiere aufwecken, opfern sie in kurzen Zeiten (2 h oder 6 h), was nicht vollständig widerspiegelt, was bei den Patienten passiert 16,18,23,24. Trotz der Entwicklung von hämorrhagischen Schockmodellen haben nur wenige Studien die Parameter (Entzündung, Apoptose, Organfunktionsstörungen) 24 h nach der Schockinduktion ausgewertet, was die Schwierigkeit dieser Art von Protokoll unterstreicht 25,26,27. Die Entwicklung von Computer- und mathematischen Modellen hat die Forschung revolutioniert. Zahlreiche mathematische Modelle des hämorrhagischen Schocks wurden entwickelt, aber die meisten dieser Modelle berücksichtigen nicht das gesamte Spektrum des Austauschs von Körperflüssigkeiten während eines hämorrhagischen Schocks und müssen vor einer möglichen klinischen Anwendbarkeit verbessert werden²⁸. Bisher ist eine der größten Herausforderungen die Entwicklung eines Tiermodells, das die Pathologie beim Menschen so genau wie möglich nachahmt.

In der Literatur ist eine Vielzahl von hämorrhagischen Schockmodellen beschrieben, die sich über vaskuläre Zugänge, entnommene Blutmengen oder den Zieldruck^{unterscheiden 13}. Im Allgemeinen können die hämorrhagischen Schockmodelle in 3 Gruppen eingeteilt werden: Blutung mit festem Volumen, Blutung mit festem Druck und unkontrollierte Blutung. Die Standardisierung und Reproduzierbarkeit mit der Blutung mit festem Volumen ist schwierig und erklärt sich durch das Verhältnis von Blutvolumen zu Körpergewicht, das linear mit dem Gewicht der Ratte abnimmt. Die Blutung mit festem Druck ist weit verbreitet, was erklärt, dass die Einstellungen (gezielter Druck, Dauer des Schocks) von einer Studie zur anderen sehr unterschiedlich sind, was es schwierig macht, die Ergebnisse von einem Modell auf ein anderes zu übertragen. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass die hämodynamische Beeinträchtigung, die eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie des hämorrhagischen Schocks spielt, nicht systematisch bewertet wird, was die Diskrepanz in den Ergebnissen zwischen den Studien verstärken könnte. Schließlich wirft das Modell der unkontrollierten Blutung, obwohl klinisch relevant, Fragen der Reproduzierbarkeit und Ethik auf. Um klinische Relevanz, Standardisierung und Reproduzierbarkeit so weit wie möglich in Einklang zu bringen, haben wir ein Mischmodell mit sowohl Festvolumen- als auch Festdruckphasen entwickelt.

In dem hier beschriebenen Modell werden die Temperatur und die Atemfrequenz 24 Stunden nach der Operation nicht verändert. Dies lässt sich dadurch erklären, dass die Operation unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird, wodurch die entzündungsfördernde Reaktion begrenzt wird. Ein hämorrhagischer Schock ist definiert als ein akutes Kreislaufversagen aufgrund von Blutverlust, der mit einem Blutdruckabfall einhergeht. Wie beim Menschen führt dieses Modell des hämorrhagischen Schocks zu einer Abnahme des mittleren arteriellen Drucks, insbesondere aufgrund einer Abnahme des diastolischen Blutdrucks. Interessanterweise und wie zuvor beschrieben, ist die Herzfrequenz nach der Wiederbelebungsphase bei diesem Modell des hämorrhagischen Schocks unverändert ^29,30,31. Der Abfall des mittleren arteriellen Drucks ist wahrscheinlich mit einer verminderten Organperfusion verbunden, was zu einer multiviszeralen Dysfunktion führt, was durch den Anstieg verschiedener plasmatischer Marker in unserem Modell (Kreatininämie, kardiales Troponin T, ASAT und ALAT) veranschaulicht werden kann. Die Störung der Sauerstoffversorgung führt zu einem anaeroben Stoffwechsel, der eine Zunahme der Laktämie zur Folge hat³². Wie bereits beschrieben, führt dieses Modell des hämorrhagischen Schocks zu einem Anstieg des Laktatspiegels^{im Blut 30}. Dieser Anstieg könnte mit der Ischämie in Verbindung gebracht werden, die auf der Ebene der Oberschenkelarterie verursacht wird. Wenn man jedoch bedenkt, dass die Tiere in der Scheingruppe eine physiologische Laktämie haben und sich dem gleichen chirurgischen Eingriff unterzogen haben wie die hämorrhagische Schockgruppe, scheint dieser Anstieg mit dem hämorrhagischen Schockprotokoll zusammenzuhängen. Zusammengenommen bestätigen alle diese Daten, dass das in dieser Studie beschriebene Protokoll die Entwicklung eines neuen relevanten Modells des hämorrhagischen Schocks bei der Ratte ermöglicht.

Die Einschränkung dieses Modells ist die Verwendung von Heparin, das unerlässlich ist, um die natürliche Gerinnung des Blutes zu reduzieren, wenn es mit Kunststoffmaterialien wie Kanülen in Kontakt kommt. Die Verwendung von Heparin kann sich jedoch auf die Koagulopathie auswirken, die mit einem traumatischen hämorrhagischen Schock einhergeht³³. An dieser Studie nehmen gesunde männliche Tiere im Alter von 11 bis 13 Wochen teil. In Anbetracht der Tatsache, dass Geschlecht, Alter und Komorbiditäten (Bluthochdruck, Diabetes usw.) die Ergebnisse beeinflussen können, wäre es relevant, deren Auswirkungen in unserem Modell zu bewerten. Im Protokoll wird der Wiederbelebungsschritt über eine Injektion von Ringer-Laktat durchgeführt, einem Kristalloid, das die Koagulopathie und das Gewebeödem fördern könnte³⁴. Obwohl die Verwendung von Blutprodukten optimal ist, sind diese knapp und verderblich, und es könnte schwierig sein, einen ausreichenden Vorrat an Rattenblut für das gesamte Protokoll zu haben. Blutprodukt- und Kristalloide/Kolloid-basierte hämorrhagische Schockmodelle sind zwei komplementäre Ansätze.

Die Stärken dieses Modells sind 1) seine hohe Reproduzierbarkeit (verdeutlicht durch die geringe Variabilität der Ergebnisse), 2) seine einfache Anwendung (die meisten Instrumente sind klassisch und vaskuläre Ansätze sind bekannt) und 3) seine klinische Relevanz, insbesondere aufgrund des Erwachens der Tiere und der multiviszeralen Dysfunktion. Basierend auf dem in der Zusatzdatei 1 beschriebenen Verhaltensscore wurden Grenzwerte festgelegt. Das Opfer wird besprochen, wenn eine Punktzahl über 9 erreicht wird, gemäß der beigefügten Tabelle. Wenn eine Punktzahl von 11 erreicht wird, wird das Tier systematisch eingeschläfert. In dieser Studie erreichte keines der Tiere eine Punktzahl von mehr als 8, und daher wurde keines von der Studie ausgeschlossen. Dies könnte erklären, warum das hier beschriebene Modell mit einer 3-mal niedrigeren Mortalitätsrate verbunden ist als die der anderen 24-Stunden-Studie (16% vs. 47%)²⁵.

Der kritische Schritt des Modells ist die hämorrhagische Schockphase. Es ist wichtig, den Druckbereich von 32-38 mmHg einzuhalten. Tatsächlich beobachteten wir, dass die Aufrechterhaltung des mittleren arteriellen Drucks unter 32 mmHg zu einem schnellen und abrupten Druckabfall führte. Umgekehrt bietet die Aufrechterhaltung eines Drucks über 38 mmHg kein Modell, das der klinischen Realität ausreichend nahe kommt. Diese Beobachtungen stimmen mit dem Intervall des mittleren arteriellen Drucks überein, das in anderen Modellen angestrebt^{wurde 13}.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das in dieser Studie beschriebene Modell des hämorrhagischen Schocks der Ratte klinisch relevant ist und sowohl für das Verständnis pathophysiologischer Mechanismen durch die Identifizierung neuer biologischer Akteure/Signalwege als auch für die Identifizierung neuer therapeutischer Strategien durch das Testen verschiedener Kandidatenmoleküle nützlich sein könnte.

Materials

1 mL syringe	TERUMO	MDSS01SE
2.5 mL syringe	TERUMO	SS*02SE1
20 mL syringe	TERUMO	MDSS20ESE
Anesthesia induction chamber	TEMSEGA	HUBBIV4
BD Microlance 3 23 G needle	Becton Dickinson	300800
BD Microlance 3 26 G needle	Becton Dickinson	304300
Blood pressure transducer	emka TECHNOLOGIES	BP_T
Buprecare	Axience	N/A	1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL
DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps	ALLGAIER instrumente medical	09-543-150
Dermal Betadine 10%	Mylan	N/A	125 mL bottle
Fine Forceps – Curved / Serrated	Fine Science Tools	11065-07
GraphPad Prism 8	GraphPad by Dotmatics	–
Heating mats	TEMSEGA	OPT/THERM_MATELASSTEREORATS
Heparin sodium	PANPHARMA	N/A	5 mL bottle, 5,000 UI/mL
IOX2 software	emka TECHNOLOGIES	IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a
Iris Scissors – ToughCut	Fine Science Tools	14058-11
Lidocaine	Fresenius	N/A	10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride
MiniHub-V3.2	TEMSEGA	PF006
Moria 201/A Vessel Clamp – Straight	Fine Science Tools	18320-11
Non sterile compresses	Raffin	70189
Non sterile drape	Dutscher	30786
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
Polyethylene tubing PE10	PHYMEP	BTPE-10
Polyethylene tubing PE50	PHYMEP	BTPE-50
Rats	Charles Rivers	–	Male WISTAR HAN (10 weeks)
Rectal probe	TEMSEGA	SONDE_TEMP_RATS
Ringer Lactates	Fresenius Kabi	964175
Scrub Betadine 4%	Mylan	N/A	125 mL bottle
Sevoflurane	Abbott	N/A	250 mL bottle, gas 100%
Sevoflurane Vaporizer	TEMSEGA	SEVOTEC3NSELEC
StatStrip lactate test strips	Nova Biomedical	47486
StatStrip Xpress lactate Meter	Nova Biomedical	47486
Sterile compresses	Laboratoire SYLAMED	211S05-50
Sterile drape	Mölnlycke	800330
Steriles gloves	MEDLINE	MSG7275
Suture	Optilene	3097141
Suture for vessels	SMI	8150046
Syringe pump	Vial médical	16010
usbAMP	emka TECHNOLOGIES	–
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Vaseline	Cooper	N/A	10 mL vial
Vitamin A Dulcis (ALLERGAN)	Allergan	N/A	10 g tube, Retinol