Kjellermembranmatrise innkapslet celleaggregering for undersøkelse av dannelse av murine miltvev

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for aggregering og innkapsling av miltceller i en halvfast kjellermembranmatrise. Kjellermembranmatrisekonstruksjoner kan brukes i tredimensjonal kultur for å studere organoidutvikling, eller for in vivo transplantasjon og vevregenereringsstudier.

Abstract

Milten er et immunorgan som spiller en nøkkelrolle i blodbårne immunresponser. Det anatomiske eller funksjonelle tapet av dette vevet øker følsomheten for alvorlige blodinfeksjoner og sepsis. Autotransplantasjon av miltskiver har blitt brukt klinisk for å erstatte tapt vev og gjenopprette immunfunksjonen. Mekanismen som driver robust og immunologisk funksjonell regenerering av miltvev er imidlertid ikke fullstendig klarlagt. Her tar vi sikte på å utvikle en metode for å aggregere og innkapsle miltceller i en halvfast matrise for å undersøke cellekravene for miltvevsdannelse. Kjellermembranmatriseinnkapslede cellekonstruksjoner er egnet til både in vitro vevskultur av tredimensjonale organoider samt transplantasjon under nyrekapselen for direkte å vurdere in vivo vevsdannelse. Ved å manipulere inngangscellene for aggregering og innkapsling, demonstrerer vi at transplantatavledede PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^– neonatale stromale celler er nødvendige for miltvevregenerering under dyretransplantasjonsmodeller.

Introduction

Traumatisk ruptur av milten og utseendet på flere miltknuter i kroppen var en av de første indikasjonene på at miltvev hadde regenerativ kapasitet ^1,2. Milttransplantasjoner ble senere introdusert i klinikken for å bevare miltvev hos pasienter som trengte akutt splenektomi³. Likevel, til tross for å være en del av klinisk praksis i flere tiår, er svært lite kjent om hvordan milten regenererer. Dyretransplantasjonsmodeller har gitt innsikt i flere parametere for miltregenerering og immunfunksjon ^4,5. Spesielt har eksperimentelle modifikasjoner av transplantatprepareringsmetoden gjort det mulig å studere vevregenerering i større detalj på cellulært og molekylært nivå.

Transplantasjoner med hele miltskiver gjennomgår en fase med massenekrose før en ny miltstruktur gjenoppbygges⁶. Den innledende fasen av transplantatnekrose antyder at hoveddelen av transplantert vev i stor grad består av røde og hvite blodlegemer og er unødvendig for miltregenerering. Dette ble undersøkt eksperimentelt ved å ekskludere hematopoietiske celler fra milttransplantater før transplantasjon under nyrekapselen mus. Her ble ikke-leukocytt/ikke-erytrocyttfraksjonen av milten, som inkluderer stromale og endotelceller, vist å være tilstrekkelig til å indusere de novo vevsdannelse⁷. Miltstromalvev kan videre behandles til en enkeltcellesuspensjon, noe som muliggjør bruk av cellesorteringsteknologier for å manipulere cellulær transplantatsammensetning. Ved selektivt å fjerne kandidatcelletyper ble det identifisert to CD45-TER-119-stromale cellepopulasjoner som var uunnværlige for transplantatutvikling: en endotellignende CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ cellepopulasjon og en bredere definert PDGFRβ⁺ mesenkymal cellepopulasjon⁸.

Konstruksjonen av transplantater fra miltceller varierer når det gjelder støttemateriell og cellebelastningsprosesser. Vevskonstruerte milter har tidligere blitt fremstilt ved å legge miltenheter på et polyglykolsyre/poly-L melkesyrepolymerstillas ^5,9. Interessant, milt stromale celler absorbert i en kollagen svamp klarte ikke å engraft, mens stromale celler aggregert og lastet over et kollagenark lettet milt regenerering⁸. Resuspensjonen av stromale miltceller inne i en Matrigel-matriks har også vist seg å indusere celleaggregering under tredimensjonale kulturbetingelser¹⁰. Denne metoden er imidlertid ikke testet for bruk i transplantasjonsmodeller. Det overordnede målet med dagens protokoll er å tvangsaggregere og innkapsle stromale celler i milten direkte i kjellermembranmatrisen, som deretter kan overføres til et tredimensjonalt in vitro vevskultursystem eller brukes som et kjøretøy for dyremodelltransplantasjoner (tilleggsfigur 1).

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til eksperimentelle protokoller godkjent av University of Queensland Animal Ethics Committee (UQBR/079/19). 1. Vevssamling og stromalcellepreparasjon Avlive 0,5-1,5 daggamle mannlige og/eller kvinnelige BALB/c nyfødte donormus ved induksjon av hypotermi ved å pakke dyr inn i silkepapiret og legge dem under knust is i >10 minutter.MERK: Denne protokollen kan tilpasses forskjellige musestammer, aldre og antall dyr. …

Representative Results

Celleaggregering er viktig for å fremme celle-til-celle-kontakt og signalering. Innkapsling av celleaggregater inne i kjellermembranmatrisen støttet begge 3-dimensjonale kulturer for in vitro vevsorganoiddannelse og lettet mekanisk levering av celler inn i nyrekapselen for transplantattransplantasjon. For å etablere disse konstruksjonene ble kjellermembranmatrisen først opprettholdt i fluidisk tilstand under iskalde forhold. Celleaggregering ble deretter oppnådd ved lagdeling av en konsentrert cellesuspensj…

Discussion

Aggregeringen av neonatale miltceller inne i et halvfast medium representerer en levedyktig metode for å generere miltkonstruksjoner. Lignende kjellermembranmatrisebaserte protokoller har blitt brukt til å initiere tredimensjonale miltkulturer¹⁰. Her demonstrerer vi at miltkonstruksjoner er like mottagelige for in vitro organoide dyrkningssystemer så vel som in vivo transplantasjonsmodeller. Det er verdt å merke seg at transplantasjon av in vitro-dyrkede miltorganoid…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm