PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証
Summary
このプロトコルは、PMA 分化型 THP-1 マクロファージの LPS および ATP 誘発死に基づいています。フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-AADの二重染色を解析し、細胞死を検出し、細胞全体を用いて走査型電子顕微鏡を用いて細胞膜の形態を観察しています。
Abstract
細胞死は、すべての生物の基本的なプロセスです。このプロトコルは、リポ多糖類(LPS)およびアデノシン三リン酸(ATP)誘導ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)-分化脂質沈着をヒト単球(THP-1)マクロファージモデルに確立し、細胞死を観察します。LPSとATPの組み合わせは、ピロトーシスの研究によく使用される古典的な炎症誘発法ですが、アポトーシスとネクロプトーシスもLPS/ATPによる刺激に反応します。通常の状況では、ホスファチジルセリンは原形質膜の内側のリーフレットにのみ局在しています。しかし、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、細胞膜は無傷のままホスファチジルセリンにさらされ、後期には細胞膜の完全性が失われます。ここでは、フローサイトメトリーを用いてアネキシンVと7-アミノアクチノマイシンD(AAD)の二重染色を解析し、全細胞からの細胞死を検出しました。その結果、LPS/ATPによる刺激後にかなりの細胞が死滅したことが示されています。走査型電子顕微鏡を用いて、個々の細胞における細胞死の可能な形態を観察します。その結果、LPS/ATPによる刺激後に細胞がピロトーシス、アポトーシス、またはネクロプトーシスを起こす可能性があることが示されています。このプロトコルは、LPS/ATPによる刺激後のマクロファージの死を観察することに焦点を当てています。その結果、LPSおよびATP刺激後の細胞死はピロトーシスに限らず、アポトーシスおよび壊死性アポトーシスも起こり得ることが示され、研究者がLPSおよびATP刺激後の細胞死をよりよく理解し、より優れた実験方法を選択するのに役立ちます。
Introduction
細胞死は、すべての生物における基本的な生理学的プロセスです。近年、細胞死が生体内の免疫とバランスに関与していることが、実質的な研究で示されています。細胞死を研究することは、病気の発症と発症をよりよく理解するのに役立ちます。プログラム細胞死のいくつかの形態が説明されており、これらのプロセスにおけるいくつかの主要な標的が特定されています。ピロトーシス、アポトーシス、およびネクロプトーシスは、内部バランスと疾患に関与する遺伝的に定義された3つのプログラム細胞死経路です1。
ピロトーシスは、膜孔の形成および細胞内容物の放出を特徴とする。活性化されたカスパーゼまたはグランザイムは、ガスデルミンを切断してN末端ドメインを分離し、その後、オリゴマー化してメンブレンに結合し、細孔を形成します2,3,4。ガスデルミン孔は、細胞膜を横切る非定型の分泌チャネルを提供し、その結果、内容物の放出やイオン流入などの下流の細胞応答が引き起こされます2,3,4。最終的に、細胞は最終的に、ニンジュリン-15によって促進される原形質膜の破裂とピロトーシス溶解を経験します。アポトーシスでは、活性化されたBaxとBakがミトコンドリア外膜上にオリゴマーを形成し、シトクロムCを放出します。これは、BCL-2ファミリーのプロアポトーシスタンパク質と抗アポトーシスタンパク質、開始剤カスパーゼ(カスパーゼ-8、-9、-10)、エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ-3、-6、-7)のバランスによって制御されます1,6,7.アポトーシスの形態学的変化には、膜ブレブ、細胞収縮、核分裂、クロマチン凝縮、およびアポトーシス体形成が含まれます6,8。受容体相互作用するセリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK3)と混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロプトーシスメカニズム1の下流の2つのコアコンポーネントです。RIPK3はMLKLを動員してリン酸化し、p-MLKLはオリゴマー化し、細胞膜と会合し、膜穿孔を開始し、イオン流入を引き起こし、細胞内浸透圧を増加させ、最終的には細胞破裂を引き起こします6,9。ガスデルミンとMLKLは、それぞれ原形質膜に結合し、ピロトーシスとネクロプトーシスを媒介し、BAX/BAKはミトコンドリアの外膜に結合してアポトーシスを媒介します6。
各経路には特定のメカニズムと結果がありますが、それらは細胞膜に同様の変化をもたらします。通常の状況では、ホスファチジルセリン(PS)は原形質膜の内葉にのみ局在しています。しかし、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの初期段階では、PSは原形質膜の外側に露出します。カスパーゼ-3/カスパーゼ-7はTMEM16およびXKRファミリーを活性化し、非対称の細胞膜を生じさせ、アポトーシス10中にPSを外部化します。ガスデルミンD媒介およびMLKL媒介Ca2+流入は、細胞膜上のリン脂質二重層の対称性の喪失およびPSの曝露をもたらす。曝露は、細胞膜の完全性が失われる前に起こる11,12。これら3種類のプログラム細胞死の膜の同様の変化に基づいて、フローサイトメトリーを使用してアネキシンV/7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)の二重染色を解析し、細胞死を検出します。カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質であるアネキシンVは、PSに対して高い親和性を有し、これは原形質膜の表面に露出したPSを検出するための高感度プローブとして機能し得る13。7-AADは、細胞膜全体を通過できない核酸染色剤です。これは、一般的に使用される核酸染料であるヨウ化プロピジウム(PI)に似ています。蛍光特性は似ていますが、7-AADは発光スペクトルが狭く、他の検出チャネルとの干渉が少なくなります。これらの類似性のため、ピロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスを区別するだけでは不十分です。フローサイトメトリーを使用して、全細胞からの細胞死を検出しました。2つ目の方法は、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して細胞膜を捕捉し、個々の細胞における細胞死の可能な形態を観察するために使用されます。
我々は、ヒト単球(THP-1)マクロファージにおけるリポ多糖(LPS)およびアデノシン三リン酸(ATP)誘導ホルボール-12-ミリスチン酸-13-アセテート(PMA)分化脂質沈着モデルを確立し、細胞死を観察した。このプロトコルは、メカニズムの調査ではなく、細胞死の観察に焦点を当てています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、PMA分化型THP-1マクロファージのLPSとATP誘発死を検出するために2つの方法を使用しました。アネキシンV/7-AAD二重染色を使用し、その結果をフローサイトメトリーで全染色から解析しました。他のフローサイトメトリー解析と同様に、未染色細胞のグループと単一染色細胞の2つのグループを、偽陽性と偽陰性の結果を排除するために設定しました。その結果、LPS/ATP刺激後、いく?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
成都伝統中国医学大学革新的中医薬薬学研究所のJiayi Sun氏とLu Yang氏にはフローサイトメトリーの支援を、State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine ResourcesのCuiping Chen氏には走査型電子顕微鏡の支援に感謝の意を表します。この研究は、中国国家自然科学基金会 [82104491]、四川省自然科学基金会 [2023NSFSC0674]、および中国博士研究員基金会 [2021M693789] の支援を受けました。
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
Referências
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