Methoden om ruimtelijke transcriptomics van botweefsels mogelijk te maken

Summary

Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om vers verkregen botweefsel te ontkalken en RNA van hoge kwaliteit te behouden. Er wordt ook een methode geïllustreerd voor het in secties verdelen van Formaline Fixed Paraffine Embedded (FFPE) monsters van niet-gedemineraliseerde botten om resultaten van goede kwaliteit te verkrijgen als er geen vers weefsel beschikbaar is of niet kan worden verzameld.

Abstract

Het begrijpen van de relatie tussen de cellen en hun locatie in elk weefsel is van cruciaal belang om de biologische processen bloot te leggen die verband houden met normale ontwikkeling en ziektepathologie. Ruimtelijke transcriptomics is een krachtige methode die de analyse van het hele transcriptoom in weefselmonsters mogelijk maakt, waardoor informatie wordt verkregen over de cellulaire genexpressie en de histologische context waarin de cellen zich bevinden. Hoewel deze methode op grote schaal is gebruikt voor veel zachte weefsels, was de toepassing ervan voor de analyses van harde weefsels zoals bot een uitdaging. De grootste uitdaging ligt in het onvermogen om RNA en weefselmorfologie van goede kwaliteit te behouden tijdens het verwerken van de harde weefselmonsters voor secties. Daarom wordt hier een methode beschreven om vers verkregen botweefselmonsters te verwerken om effectief ruimtelijke transcriptomics-gegevens te genereren. De methode maakt het mogelijk om de monsters te ontkalken, waardoor succesvolle weefselsecties met behoud van morfologische details worden verkregen, terwijl RNA-afbraak wordt vermeden. Daarnaast worden gedetailleerde richtlijnen gegeven voor monsters die eerder in paraffine waren ingebed, zonder demineralisatie, zoals monsters die zijn verzameld bij weefselbanken. Met behulp van deze richtlijnen worden hoogwaardige ruimtelijke transcriptomics-gegevens getoond die zijn gegenereerd uit weefselbankmonsters van primaire tumor- en longmetastasen van botosteosarcoom.

Introduction

Bot is een gespecialiseerd bindweefsel dat voornamelijk bestaat uit vezels van collageen type 1 en anorganische zouten¹. Als gevolg hiervan is bot ongelooflijk sterk en stijf, terwijl het tegelijkertijd licht en traumabestendig is. De grote kracht van bot komt voort uit het mineraalgehalte. Sterker nog, voor elke gegeven toename van het percentage mineraalgehalte neemt de stijfheid toe met een factor^vijf. Bijgevolg worden onderzoekers geconfronteerd met aanzienlijke problemen wanneer ze door middel van histologische doorsnede de biologie van een botmonster analyseren.

Niet-ontkalkte bothistologie is haalbaar en soms vereist, afhankelijk van het type onderzoek (bijv. om de microarchitectuur van bot te bestuderen); Het is echter een grote uitdaging, vooral als de exemplaren groot zijn. In deze gevallen vereist weefselverwerking voor histologische doeleinden verschillende aanpassingen van de standaardprotocollen en -technieken³. Over het algemeen wordt botweefsel direct na fixatie ontkalkt om gemeenschappelijke histologische evaluaties uit te voeren, een proces dat enkele dagen tot enkele weken kan duren, afhankelijk van de grootte van het weefsel en het gebruikte ontkalkingsmiddel⁴. Ontkalkte secties worden vaak gebruikt voor het onderzoek van het beenmerg, de diagnose van tumoren, enz. Er zijn drie hoofdtypen ontkalkingsmiddelen: sterke zuren (bijv. salpeterzuur, zoutzuur), zwakke zuren (bijv. mierenzuur) en chelaatvormers (bijv. ethyleendiaminettracetinezuur of EDTA)⁵. Sterke zuren kunnen bot zeer snel ontkalken, maar ze kunnen de weefsels beschadigen; zwakke zuren komen veel voor en zijn geschikt voor diagnostische procedures; Chelaatvormers worden verreweg het meest gebruikt en zijn geschikt voor onderzoekstoepassingen, aangezien het demineralisatieproces in dit geval langzaam en zacht is, waardoor de morfologie van hoge kwaliteit behouden blijft en de informatie over genen en eiwitten behouden blijft, zoals vereist door veel procedures (bijv. In situ hybridisatie, immunokleuring). Wanneer echter het hele transcriptoom moet worden bewaard, zoals voor genexpressie-analyses, kan zelfs een langzame en zachte demineralisatie schadelijk zijn. Daarom zijn betere benaderingen en methoden nodig wanneer de morfologische analyse van de weefsels moet worden gecombineerd met genexpressieanalyses van de cellen.

Dankzij recente verbeteringen in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) en ruimtelijke transcriptomics, is het nu mogelijk om de genexpressie van een weefselmonster te bestuderen, zelfs wanneer formalinefixatie paraffine-inbedding (FFPE) werd gebruikt om de weefselmonsters op te slaan ^6,7,8. Deze mogelijkheid heeft toegang ontsloten tot een groter aantal monsters, zoals die zijn opgeslagen in weefselbanken over de hele wereld. Als scRNA-seq moet worden gebruikt, is RNA-integriteit de belangrijkste vereiste; in het geval van ruimtelijke transcriptomics van FFPE-monsters zijn echter zowel hoogwaardige weefselsecties als hoogwaardig RNA nodig om de genexpressie binnen de histologische context van elke weefselsectie te visualiseren. Hoewel dit gemakkelijk is bereikt met zachte weefsels, kan hetzelfde niet gezegd worden van harde weefsels zoals bot. Voor zover wij weten, is er zelfs nooit een onderzoek met ruimtelijke transcriptomics uitgevoerd op FFPE-botmonsters. Dit komt door het ontbreken van protocollen die FFPE-botweefsel effectief kunnen verwerken met behoud van hun RNA-inhoud. Hier wordt eerst een methode aangereikt om vers verkregen botweefselmonsters te verwerken en te ontkalken en tegelijkertijd RNA-afbraak te voorkomen. Vervolgens, in het besef van de noodzaak van transcriptomics-analyse van de FFPE-monsters die wereldwijd in weefselbanken zijn verzameld, worden ook ontwikkelde richtlijnen gepresenteerd om FFPE-monsters van niet-gedemineraliseerde botten op de juiste manier te behandelen.

Protocol

Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de University of Pittsburgh School of Dental Medicine. 1. Methode om FFPE-blokken botweefselmonsters te bereiden die demineralisatie vereisen Bereiding van reagentia en materialenBereid EDTA 20% pH 8.0 voor. Los voor 1 L 200 g EDTA op in 800 ml ultrapuur water, pas de pH aan tot 8,0 met natriumhydroxide 10 N en breng h…

Representative Results

De hier gepresenteerde methode beschrijft hoe vers geïsoleerde botten moeten worden verwerkt om gedemineraliseerde FFPE-monsters te verkrijgen die gemakkelijk kunnen worden doorgesneden met een microtoom met behoud van de RNA-integriteit (Figuur 1). De methode is met succes toegepast op het dijbeen van muizen, maar kan worden gevolgd voor andere botweefselmonsters van vergelijkbare afmetingen, of kan worden aangepast voor grotere botmonsters (bijv. menselijke monsters) door alle parameters …

Discussion

Hier wordt een gedetailleerde methode geboden om FFPE-blokken van ontkalkte botten voor te bereiden en de RNA-integriteit te behouden voor sequencing (d.w.z. next-generation sequencing (NGS)) of voor andere RNA-gerelateerde technieken (d.w.z. in situ hybridisatie, kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR), enz.).

De methode maakt gebruik van EDTA om botweefselmonsters te ontkalken; de EDTA-incubatie zorgt voor een langzame maar fijne demineralisatie van de …

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.