Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo
Summary
Aquí se describe un método que se puede utilizar para obtener imágenes de cinco o más parámetros fluorescentes mediante microscopía inmunofluorescente. Se describe una línea de análisis para extraer células individuales de estas imágenes y realizar análisis de células individuales a través de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, que pueden identificar subconjuntos de células en secciones de tejido.
Abstract
El uso de la histología para investigar la diversidad de células inmunitarias en secciones de tejido, como las derivadas del sistema nervioso central (SNC), está críticamente limitado por el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez. La mayoría de los subconjuntos de células inmunitarias se han definido mediante citometría de flujo mediante el uso de combinaciones complejas de marcadores de proteínas, que a menudo requieren cuatro o más parámetros para identificarlos de manera concluyente, lo que está más allá de las capacidades de la mayoría de los microscopios convencionales. A medida que la citometría de flujo disocia los tejidos y pierde información espacial, existe la necesidad de técnicas que puedan retener la información espacial mientras interrogan las funciones de los tipos de células complejas. Estos problemas se abordan aquí mediante la creación de un método para ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden visualizar mediante la recopilación de las señales de fluoróforos superpuestos espectralmente y el uso de la desmezcla espectral para separar las señales de cada fluoróforo individual. A continuación, estas imágenes se procesan mediante una canalización de análisis para tomar imágenes histológicas de alto parámetro y extraer células individuales de estas imágenes para que las propiedades fluorescentes únicas de cada célula se puedan analizar a nivel de una sola célula. Mediante el uso de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, las células se pueden perfilar en subconjuntos y mapear de nuevo en las secciones de histología no solo para cuantificar su abundancia, sino también para establecer cómo interactúan con el entorno tisular. En general, se demuestra la simplicidad y el potencial del uso de la citometría de histoflujo para estudiar poblaciones inmunitarias complejas en secciones de histología.
Introduction
La inflamación impulsada por las células del sistema inmunitario y las células gliales puede contribuir a trastornos crónicos del SNC en los que cada población puede promover la actividad de la otra 1,2,3. La comprensión de cómo el sistema inmunitario interactúa con estos elementos del SNC para promover la inflamación del SNC es actualmente un tema de interés importante y se ha visto facilitado en gran medida por técnicas de alto parámetro, como la secuenciación de ARN unicelular. A través de la secuenciación de ARN unicelular, hemos descubierto que existe una amplia comunicación entre las células gliales y el sistema inmunitario en varios trastornos del SNC 4,5,6. Comprender cómo estas interacciones están afectando a estos trastornos será crucial para dilucidar la biología de estas enfermedades.
Un problema con los análisis de secuenciación de una sola célula es que estas técnicas requieren que el tejido se interrumpa para obtener células individuales o núcleos, lo que resulta en una pérdida completa de información espacial. Saber dónde existe una célula en un tejido es fundamental para comprender el papel de la célula en la conducción de la inflamación. Por ejemplo, las células inmunitarias como las células B pueden concentrarse en el SNC durante la neuroinflamación; sin embargo, rara vez entran en el parénquima del SNC y en su lugar se concentran en las barreras del SNC7. Dada su localización, es poco probable que estas células contribuyan a la inflamación del SNC al interactuar físicamente con las células gliales en el parénquima del SNC, lo que sugiere que cualquier interacción que puedan tener con las células gliales ocurriría a través de factores secretados. Además, la patología que ocurre en los trastornos del SNC a menudo tiene una estructura 8,9 tal que la localización de una célula en el tejido podría determinar críticamente si está contribuyendo activamente al trastorno o es un espectador. Por lo tanto, el uso de la orientación espacial para evaluar el papel de una célula en la patología es esencial.
Por lo general, el estudio de las células en los tejidos se ha llevado a cabo mediante el uso de inmunohistoquímica o microscopía de fluorescencia inmunitaria. Un problema con estas técnicas es que, por lo general, solo pueden obtener imágenes de hasta cuatro parámetros simultáneamente. Esta es una limitación importante de estas técnicas, ya que sabemos por citometría de flujo y análisis de secuenciación de ARN unicelular que muchas poblaciones celulares requieren dos o más parámetros para su identificación; Además, el número de parámetros necesarios suele aumentar cuando se buscan subconjuntos específicos de un tipo de célula10. Por lo tanto, no es práctico utilizar técnicas de imagen estándar para estudiar cómo pueden estar interactuando subconjuntos de células dentro de un tejido.
Este problema se ha superado parcialmente a través de nuevos métodos de alto parámetro que pueden retener información espacial, como la secuenciación espacial de ARN11 y la citometría de masasde imágenes 12. Si bien estas técnicas son valiosas, tienen varios problemas, como no estar ampliamente disponibles, reducir los datos tridimensionales a dos dimensiones y requerir una experiencia considerable para su ejecución. Otra técnica conocida como tinción secuencial, en la que los tejidos se tiñen con un conjunto de anticuerpos seguido de la inactivación del conjunto anterior de anticuerpos antes de teñirse con otro conjunto de anticuerpos, puede lograr una histología de alto parámetro sin necesidad de equipo especializado o experiencia 13,14,15 . Sin embargo, la tinción secuencial puede ser extremadamente laboriosa y requiere una gran cantidad de tiempo de microscopía, lo que puede ser poco práctico para los laboratorios que no poseen un microscopio personal. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas que puedan ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez en microscopios que estén ampliamente disponibles y de manera oportuna.
Una vez que se han adquirido los datos de alto parámetro, surge otro problema: es poco probable que los métodos convencionales de análisis de imágenes analicen con éxito los datos. Técnicas como el conteo manual o el umbral solo son viables si el análisis consta de un solo parámetro o si varios marcadores tienen la misma localización donde solo se cuentan las señales superpuestas. Esta limitación hace que el análisis tradicional sea inadecuado para trabajar con conjuntos de datos de parámetros altos. El análisis exitoso de estos conjuntos de datos se ha logrado mediante la segmentación de células individuales a partir de imágenes histológicas y luego la realización de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo para identificar los tipos de células16,17. Sin embargo, otro problema que afecta a estos análisis es que solo funcionan para conjuntos de datos en los que todas las celdas de interés están físicamente separadas entre sí, ya que estas técnicas no emplean métodos que puedan separar con precisión las celdas que están en contacto físico. Por lo tanto, se requiere un método más nuevo que pueda realizar análisis de células individuales en secciones de histología, incluso si las células están en contacto físico.
En este artículo, se describe un protocolo simple llamado citometría de histoflujo que ha sido introducido previamente18 y que amplía el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes simultáneamente utilizando microscopios ampliamente disponibles. Este protocolo funciona mediante la tinción de tejidos con tintes superpuestos espectralmente y luego el uso de la compensación espectral para eliminar el sangrado de los canales superpuestos para obtener tinciones individuales claras. Para facilitar el análisis de imágenes histológicas de alto parámetro, se describe una línea de análisis detallada que extrae células individuales de secciones de tejido con el fin de clasificar las células en poblaciones distintas utilizando estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo. Este protocolo funciona en tejidos donde las células están presentes de manera difusa y en tejidos donde las células están muy compactadas entre sí, lo que hace que esta técnica sea versátil para el estudio de tejidos como el SNC tanto en la homeostasis como en la neuroinflamación. La citometría de histoflujo es, por lo tanto, una técnica útil para estudiar las interacciones entre tipos celulares complejos que requieren múltiples marcadores celulares para definir las células mientras se mantiene la información espacial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe el uso de la citometría de histoflujo, técnica que ha sido validada previamente18. Se demuestra que cuando se tiñen secciones de tejido con colorantes superpuestos espectralmente, ese sangrado a través de los canales se puede eliminar mediante compensación espectral, lo que da como resultado un mayor número de parámetros fluorescentes que se resuelven claramente de lo que normalmente sería posible con métodos convencionales. Dado que las imágenes histológicas de alto p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Plataforma de Microscopía Avanzada del Hotchkiss Brain Institute por la infraestructura y la experiencia en imágenes. RWJ contó con el apoyo de una beca postdoctoral del programa Eyes High de la Universidad de Calgary y de una beca educativa sin restricciones de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y Roche Canadá. VWY recibió apoyo salarial del programa de Nivel 1 de la Cátedra de Investigación de Canadá. Este trabajo fue apoyado por fondos operativos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud 1049959, la Subvención 3236 de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple Dirigido por el Congreso. La figura 1 se crea con BioRender.com. Las cifras adaptadas en esta publicación se publicaron originalmente en The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott y V. Wee Yong. 2023. Análisis de célula única de imágenes histológicas de alto parámetro mediante citometría de histoflujo. J. Immunol. 210: 2038-2049. Derechos de autor © [2023]. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Referências
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
