Génération et analyse d’images histologiques à paramètres élevés avec la cytométrie en flux histologique
Summary
La description ici est une méthode qui peut être utilisée pour imager cinq paramètres fluorescents ou plus par microscopie immunofluorescente. Un pipeline d’analyse permettant d’extraire des cellules uniques à partir de ces images et d’effectuer des analyses de cellules uniques à l’aide de stratégies de type cytométrie en flux est décrit, qui permet d’identifier des sous-ensembles de cellules dans des coupes de tissus.
Abstract
L’utilisation de l’histologie pour étudier la diversité des cellules immunitaires dans des coupes de tissus telles que celles dérivées du système nerveux central (SNC) est limitée de manière critique par le nombre de paramètres fluorescents qui peuvent être imagés en une seule fois. La plupart des sous-ensembles de cellules immunitaires ont été définis à l’aide de la cytométrie en flux à l’aide de combinaisons complexes de marqueurs protéiques, nécessitant souvent quatre paramètres ou plus pour être identifiés de manière concluante, ce qui dépasse les capacités de la plupart des microscopes conventionnels. Comme la cytométrie en flux dissocie les tissus et perd des informations spatiales, il est nécessaire de disposer de techniques capables de conserver des informations spatiales tout en interrogeant les rôles de types cellulaires complexes. Ces problèmes sont résolus ici par la création d’une méthode permettant d’augmenter le nombre de paramètres fluorescents qui peuvent être imagés en collectant les signaux de fluorophores qui se chevauchent spectralement et en utilisant le démélange spectral pour séparer les signaux de chaque fluorophore individuel. Ces images sont ensuite traitées à l’aide d’un pipeline d’analyse pour prendre des images histologiques à paramètres élevés et extraire des cellules uniques de ces images afin que les propriétés fluorescentes uniques de chaque cellule puissent être analysées au niveau d’une seule cellule. À l’aide de stratégies de type cytométrie en flux, les cellules peuvent ensuite être profilées en sous-ensembles et cartographiées sur les coupes histologiques pour non seulement quantifier leur abondance, mais aussi établir comment elles interagissent avec l’environnement tissulaire. Dans l’ensemble, la simplicité et le potentiel de l’utilisation de la cytométrie histoflux pour étudier des populations immunitaires complexes dans des coupes histologiques sont démontrés.
Introduction
L’inflammation provoquée par les cellules du système immunitaire et les cellules gliales peut contribuer à des troubles chroniques du SNC où chaque population peut favoriser l’activité de l’autre 1,2,3. Comprendre comment le système immunitaire interagit avec ces éléments du SNC pour favoriser l’inflammation du SNC est actuellement un sujet d’intérêt majeur et a été grandement facilité par des techniques à paramètres élevés telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire. Grâce au séquençage de l’ARN unicellulaire, nous avons découvert qu’il existe une communication étendue entre les cellules gliales et le système immunitaire dans plusieurs troubles du SNC 4,5,6. Comprendre comment ces interactions affectent ces troubles sera crucial pour élucider la biologie de ces maladies.
L’un des problèmes avec les analyses de séquençage de cellules uniques est que ces techniques nécessitent que le tissu soit perturbé pour obtenir des cellules ou des noyaux uniques, ce qui entraîne une perte complète d’informations spatiales. Savoir où se trouve une cellule dans un tissu est essentiel pour comprendre le rôle de la cellule dans l’inflammation. Par exemple, les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B peuvent se concentrer dans le SNC pendant la neuroinflammation ; cependant, ils pénètrent rarement dans le parenchyme du SNC et se concentrent plutôt dans les barrières du SNC7. Compte tenu de leur localisation, il est peu probable que ces cellules contribuent à l’inflammation du SNC en interagissant physiquement avec les cellules gliales du parenchyme du SNC, ce qui suggère que toute interaction qu’elles pourraient avoir avec les cellules gliales se produirait par le biais de facteurs sécrétés. De plus, la pathologie qui se produit dans les troubles du SNC a souvent une structure 8,9 telle que la localisation d’une cellule dans le tissu pourrait déterminer de manière critique si elle contribue activement au trouble ou si elle est un spectateur. Ainsi, l’utilisation de l’orientation spatiale pour évaluer le rôle d’une cellule dans la pathologie est essentielle.
L’étude des cellules dans les tissus a généralement été réalisée à l’aide de l’immunohistochimie ou de la microscopie à fluorescence immunitaire. Un problème avec ces techniques est qu’elles ne peuvent généralement imager que jusqu’à quatre paramètres simultanément. Il s’agit d’une limitation majeure de ces techniques, car nous savons, grâce à la cytométrie en flux et aux analyses de séquençage de l’ARN unicellulaire, que de nombreuses populations cellulaires nécessitent deux paramètres ou plus pour leur identification ; En outre, le nombre de paramètres requis augmente généralement lors de la recherche de sous-ensembles spécifiques d’un typede cellule 10. Ainsi, il n’est pas pratique d’utiliser des techniques d’imagerie standard pour étudier comment des sous-ensembles de cellules peuvent interagir au sein d’un tissu.
Ce problème a été partiellement surmonté grâce à de nouvelles méthodes à paramètres élevés qui peuvent conserver des informations spatiales, telles que le séquençage spatial de l’ARN11 et l’imagerie par cytométrie de masse12. Bien que ces techniques soient précieuses, elles présentent plusieurs problèmes, tels que le fait qu’elles ne sont pas largement disponibles, qu’elles réduisent les données tridimensionnelles en deux dimensions et qu’elles nécessitent une expertise considérable pour être exécutées. Une autre technique connue sous le nom de coloration séquentielle, dans laquelle les tissus sont colorés avec un ensemble d’anticorps suivi de l’inactivation de l’ensemble précédent d’anticorps avant la coloration avec un autre ensemble d’anticorps, peut obtenir une histologie à paramètres élevés sans avoir besoin d’équipement spécialisé ou d’expertise 13,14,15 . Cependant, la coloration séquentielle peut être extrêmement laborieuse et nécessite beaucoup de temps de microscopie, ce qui peut être peu pratique pour les laboratoires qui ne possèdent pas de microscope personnel. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point des techniques capables d’augmenter le nombre de paramètres fluorescents pouvant être imagés en même temps sur des microscopes largement disponibles et en temps opportun.
Une fois les données à paramètres élevés acquises, un autre problème se pose : les méthodes d’analyse d’images conventionnelles ont peu de chances d’analyser avec succès les données. Des techniques telles que le comptage manuel ou le seuillage ne sont viables que si l’analyse consiste en un seul paramètre ou si plusieurs marqueurs ont la même localisation où seuls les signaux qui se chevauchent sont comptés. Cette limitation rend l’analyse traditionnelle inadéquate pour travailler avec des ensembles de données à paramètres élevés. L’analyse réussie de ces ensembles de données a été réalisée en segmentant des cellules uniques à partir d’images histologiques, puis en mettant en œuvre des stratégies de contrôle de type cytométrie en flux pour identifier les types de cellules16,17. Cependant, un autre problème qui affecte ces analyses est qu’elles ne fonctionnent que pour des ensembles de données dans lesquels toutes les cellules d’intérêt sont physiquement séparées les unes des autres, car ces techniques n’utilisent pas de méthodes capables de séparer avec précision les cellules en contact physique. Ainsi, une méthode plus récente est nécessaire pour effectuer des analyses de cellules uniques sur des coupes histologiques même si les cellules sont en contact physique.
Dans cet article, nous décrivons un protocole simple appelé cytométrie histoflux, qui a déjà été introduit18 et qui augmente le nombre de paramètres fluorescents pouvant être imagés simultanément à l’aide de microscopes largement disponibles. Ce protocole fonctionne en colorant les tissus avec des colorants qui se chevauchent spectralement, puis en utilisant la compensation spectrale pour éliminer le saignement des canaux qui se chevauchent afin d’obtenir des colorants uniques clairs. Pour faciliter l’analyse d’images histologiques à paramètres élevés, un pipeline d’analyse détaillé est décrit qui extrait des cellules uniques de coupes de tissus dans le but de trier les cellules en populations distinctes à l’aide de stratégies de type cytométrie en flux. Ce protocole fonctionne dans les tissus où les cellules sont présentes de manière diffuse et dans les tissus où les cellules sont étroitement compactées les unes contre les autres, ce qui rend cette technique polyvalente pour l’étude de tissus comme le SNC dans l’homéostasie et la neuroinflammation. La cytométrie histoflux est donc une technique utile pour étudier les interactions entre des types de cellules complexes qui nécessitent plusieurs marqueurs cellulaires pour définir les cellules tout en conservant des informations spatiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, l’utilisation de la cytométrie histoflux est décrite, une technique qui a été validée précédemment18. Il est démontré que lors de la coloration de coupes de tissus avec des colorants qui se chevauchent spectralement, cette fuite à travers les canaux peut être éliminée à l’aide de la compensation spectrale, ce qui permet de résoudre clairement un plus grand nombre de paramètres fluorescents que ce qui serait normalement possible avec les méthodes conventionnelles. Comme le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la plate-forme de microscopie avancée du Hotchkiss Brain Institute pour son infrastructure et son expertise en imagerie. RWJ a été soutenu par des bourses postdoctorales du programme Eyes High de l’Université de Calgary et par une bourse de formation sans restriction de la Société canadienne de la sclérose en plaques et de Roche Canada. VWY a reçu un soutien salarial du Programme des chaires de recherche du Canada de niveau 1. Ces travaux ont été financés par des fonds de fonctionnement provenant de la subvention 1049959 des Instituts de recherche en santé du Canada, de la subvention 3236 de la Société canadienne de la sclérose en plaques et du programme de recherche sur la sclérose en plaques dirigé par le Congrès du département de la Défense des États-Unis. La figure 1 est créée avec BioRender.com. Les chiffres adaptés dans cette publication ont été initialement publiés dans The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott et V. Wee Yong. 2023. Analyse unicellulaire d’images histologiques à paramètres élevés à l’aide de la cytométrie histoflux. J. Immunol. 210: 2038-2049. Droit d’auteur © [2023]. L’Association américaine des immunologistes, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Referências
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
