פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)
Summary
זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.
Abstract
הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) אצל חולדות הם קטנים, מבריק, דמוי שקד מבנים המכילים נוירונים אוהד. נוירונים אלה מספקים innervations אוהד לראש ואזורים הצוואר והם מהווים אוכלוסייה היטב מאופיין והומוגני יחסית (4). נוירונים הסימפתטית תלויים בגורם גדילה עצבי (NGF) לצמיחה, הישרדות בידול axonal והתפשטות רחבה הזמינות של NGF מקלה תרבותם מניפולציה ניסויית (2, 3, 6). מסיבות אלה, נוירונים בתרבית אוהד כבר בשימוש במגוון רחב של מחקרים כולל פיתוח בידול עצב, מנגנונים של מות תאים מתוכנת ופתולוגיים, ואת הולכת אותות (1, 2, 5, 6). לנתח את SCG מן החולדות יומו נוירונים culturing אוהד לא מאוד מסובך וניתן לשלוט די מהר. במאמר זה נתאר בפירוט כיצד לנתח את SCG מ גורים עכברוש היילוד להשתמש בהם כדי להקים תרבויות של נוירונים אוהד. המאמר כמו כן נתאר את הצעדים ההכנה ואת ריאגנטים שונים וציוד הנחוצים כדי להשיג זאת.
Protocol
Discussion
אנו משתמשים חולדות Sprague Dawley עבור התרבויות שלנו.
קח את הזמן והטיפול כאשר מנקים את הגרעינים. הסר את כל פסולת, כלי דם ושומן. שלב זה חשוב בהבטחת תרבות פחות או יותר הומוגני חינם של סוגי תאים זרים. תוספת של uridine/5-FDU יהיה בעיקר לחסל את התאים הלא העצבית (mitotic) הנותרי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ רוצה להודות מעבדה חברי שובהאש ביזוואז, אנדרו Sproul, וראיין Willet לאימונים שלה לנתח והקציר נוירונים אוהד. נתמכות על ידי תרומות של NIH-NINDS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
Referências
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Biologia do Desenvolvimento. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
