Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)
Summary
Este es un protocolo que describe cómo aislar y cultivar primaria neuronas simpáticas de los ganglios cervical superior (SCG) de las crías recién nacido.
Abstract
Los ganglios cervical superior (SCG) en las ratas son pequeños, brillantes, con forma de almendra estructuras que contienen las neuronas simpáticas. Estas neuronas proporcionan inervación simpática de la cabeza y el cuello y las regiones que constituyen una población bien caracterizados y relativamente homogénea (4). Las neuronas simpáticas dependen de factor de crecimiento nervioso (NGF) para el crecimiento de la supervivencia, diferenciación y axonal y de la amplia disponibilidad de NGF facilita su cultura y su manipulación experimental (2, 3, 6). Por estas razones, cultivos de neuronas simpáticas se han utilizado en una amplia variedad de estudios, incluyendo el desarrollo neuronal y la diferenciación, los mecanismos de muerte celular programada y patológica, y la transducción de señales (1, 2, 5 y 6). La disección de los SCG de ratas recién nacidas y las neuronas simpáticas de cultivo no es muy complicada y se puede dominar con bastante rapidez. En este artículo vamos a describir en detalle cómo diseccionar el SCG de crías de rata recién nacida y de utilizarlos para establecer cultivos de neuronas simpáticas. El artículo también se describen los pasos preparatorios y de los diversos reactivos y equipos que se necesitan para lograr este objetivo.
Protocol
Discussion
Utilizamos ratas Sprague Dawley, de nuestras culturas.
Tómese su tiempo y atención a la limpieza de los ganglios. Eliminar todos los restos, los vasos sanguíneos y grasa. Este paso es importante para asegurar una cultura que es más o menos homogénea y libre de los tipos de células extrañas. La adición de uridine/5-FDU gran medida eliminar cualquier resto de las células no neuronales (mitosis) contaminación de la cultura o al menos inhibir su proliferación.
Además, durante el paso de la disociación, ser paciente …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Subhas Biswas, Andrew Sproul, y Willet Ryan por su formación en la disección y la cosecha de las neuronas simpáticas. Apoyado por becas de los NIH, NINDS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
Referências
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Biologia do Desenvolvimento. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
