Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü
Summary
Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.
Abstract
Sıçanlarda üstün servikal ganglion (SCG), sempatik nöronlar içeren küçük, parlak, badem biçimli yapılar. Bu nöronlar, baş ve boyun bölgeleri için sempatik innervations sağlamak ve iyi karakterize ve görece homojen bir nüfus (4) oluşturmaktadır. Sempatik nöronlar NGF, kullanılabilirlik, kendi kültür ve deneysel manipülasyon (2, 3, 6) kolaylaştırır, hayatta kalma, farklılaşma ve aksonal büyüme ve yaygın sinir büyüme faktörü (NGF) bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı, kültürlü, sempatik nöronlar nöronal gelişim ve farklılaşma, ve patolojik programlanmış hücre ölümü mekanizmaları ve sinyal iletimi (1, 2, 5 ve 6) da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede çalışmalar kullanılmaktadır. Yeni doğan sıçan ve kültür sempatik nöronlar SCG Diseksiyon çok karmaşık değildir ve oldukça hızlı bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, yeni doğan sıçan yavrular SCG incelemek ve sempatik nöronların kültürleri kurmak için bunları kullanmak için ne kadar detaylı bir şekilde anlatacağız. Makalede ayrıca, hazırlık adımları ve bunu başarmak için gerekli olan çeşitli reaktifler ve ekipman anlatacağız.
Protocol
Discussion
Biz kültürlerin Sprague Dawley rat kullanın.
Ganglionlar temizlik zaman ve özen. Tüm artıkları, kan damarları ve yağ çıkarın. Bu adım, daha az ya da çok homojen ve gereksiz hücre tiplerinin bir kültür sağlanmasında önemlidir. Uridine/5-FDU eklenmesi, büyük ölçüde kültür kirlenmesine kalan (mitotik) non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırılması ya da en azından onların çoğalmasını baskıladığı.
Buna ek olarak, ayrışma adım sırasında, sabırlı olun ve plakalar üzerine numaralı ser…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NZ sempatik nöronlar diseksiyon ve hasat onu eğitim için laboratuar üyeleri Subhas Biswas, Andrew Sproul ve Ryan Willet teşekkür etmek istiyorum. NIH-NINDS gelen bağışlarla desteklenir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades – 5.5 | Tool | Roboz | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Biosciences | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma | U3003 | |
| 5-Fluoro-5′ deoxyuridine | Reagent | Sigma | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Bioproduct | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Falcon | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning, Nunclone |
Referências
- Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons – I. Sympathetic Neurons. Biologia do Desenvolvimento. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).
