تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

الهدف العام من هذا الإجراء هو معالجة جزيئات الحمض النووي القصيرة التي يبلغ طولها 100 نانومتر مع قوى بصرية ثابتة معايرة جيدا. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط الحمض النووي على أحد طرفيه بزلة غطاء والآخر بكرة مجهرية من البوليسترين. بعد ذلك ، تتم محاذاة الملقط البصري ومعايرته.

ثم يمتد الحمض النووي بعيدا عن السطح بمزيج من قوى التدرج وقوى التشتت المؤثرة على الكرة المجهرية. أخيرا ، يتم تمديد الحمض النووي عن طريق محاصرة الخرزة في المنطقة الخطية للجهد. تم استخدام البروتوكول لدراسة الخواص الميكانيكية لحركية ربط الحمض النووي وبروتين الحمض النووي ، وكان مفيدا أيضا في توضيح أهمية الظروف الحدودية على مرونة تركيبات الحمض النووي القصيرة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن محاذاة ومعايرة الملقط البصري بالقوة الثابتة صعبة ومعقدة. تشتمل الملقط البصري على شعاع من ليزر 1064 نانومتر ينقسم إلى حزمتين مستقطبتين متعامدين. يستخدم أحدهما لمعالجة الجزيء الحيوي والآخر يستخدم لأغراض المعايرة.

يتم التحكم في شدة شعاع التلاعب بواسطة عاكس بصري AO أو OD. ثم يتم إعادة دمج الحزم مع مقسم شعاع استقطاب آخر. يتم تركيز الحزم بإحكام من خلال هدف مجهر غمر الزيت APO 60 × 1.4 على خلية العينة. يتم دمج إعداد الملقط هذا مع مجهر المجال الساطع محلي الصنع يوفر إضاءة من مصباح هالوجين يركز على غرفة العينة بواسطة مكثف.

يتم فصل صورة المجال الساطع عن ضوء الليزر بواسطة مرآة ثنائية اللون ثم يتم تصويرها على كاميرتين CCD. يعمل CCD الواحد كوسيلتنا الأساسية للحصول على البيانات وهو برنامج يتم تشغيله للحصول على معدلات أخذ عينات دقيقة. بينما يتم استخدام CCD الآخر لتصوير كرة مرجعية واحدة عالقة ، يعمل موضعها كنظام للتحكم في التغذية الراجعة للتعويض عن الانجراف في المجهر.

يتم وضع العينة بشكل خشن فيما يتعلق بالهدف من خلال مرحلة XY ، ومن ثم يمكن وضعها بدقة بواسطة مرحلة piso ثلاثية الأبعاد مدمجة. يتم جمع ضوء الليزر المتناثر والمرسل إلى الأمام بواسطة مكثف المجال الساطع والتركيز على كاشف الصور لمعايرة حجم الخرزة ، وتحميل غرفة العينة بمحلول مشتت من كريات البوليسترين المجهرية بقطر 800 نانومتر مخففة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. اتركه لمدة 10 إلى 15 دقيقة ثم اغسله برفق مع المخزن المؤقت.

لإزالة الكريات المجهرية الزائدة ، حدد موقع كرة مجهرية عالقة بشكل عشوائي على زجاج الغطاء واضبط ارتفاع حجرة العينة حتى يصبح الكرة المجهرية أقل من الميكرومتر الواحد تقريبا. لإنشاء صورة غير مركزة لقياس الحجم الظاهري للصورة باستخدام عرض المختبر أولا، ابحث عن مركز الكرة المجهرية باستخدام وظيفة مطابقة النمط الهندسي. بعد ذلك ، قم بإنشاء ملف تعريف كثافة شعاعي للكرة المجهرية بمتوسط 360 درجة.

حول مركز كل مقطع عرضي تناسب المظهر الجانبي الشعاعي ، والذي يتوافق مع حلقة بيضاء في كل صورة من صور المجال الساطع مع وظيفة تربيعية. للعثور على ذروة السطوع ، يمكن استخدام المسافة بين هذه القمة والمركز كمقياس للحجم الظاهري للحبة باستخدام مرحلة البيزو المعايرة التي تزيد تدريجيا من الموضع المحوري للكرة المجهرية والحصول على صورة في كل موضع محوري باستخدام كاميرا CCD. كرر تحليل الصورة لكل صورة متتالية لربط الحجم الظاهري للكرة المجهرية بموقعها المحوري.

تبلغ الدقة المحورية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة حوالي 1.4 نانومتر لرسم خريطة للإمكانات البصرية لحزمة التلاعب التي تبدأ بالكولين ، ومحاذاة شعاع التلاعب وحزمة المعايرة مع إيقاف تشغيل شعاع التلاعب. حصر كرة مجهرية حرة داخل المصيدة الأكثر صلابة لحزمة المعايرة. الآن قم بتشغيل شعاع التلاعب.

نظرا لأنه أضعف بكثير من شعاع المعايرة ، فإن الوضع المحوري للكرة المجهرية سيكون مضطربا قليلا. يمكن قياس التغيير الناتج في الموضع المحوري من صور المجال الساطع غير المركزة كما هو موضح بالفعل. قم بتحويل التركيز البؤري المحوري وكرر رسم دلتا X للإزاحة مقابل الموضع المحوري لتركيز شعاع المعايرة.

يحدد الموضع المحوري المقابل لأكبر إزاحة للكرة المجهرية مركز المنطقة الخطية للمصيدة البصرية. لتمديد عينة الحمض النووي ، قم بتركيب الغرفة التي تحتوي على جزيئات الحمض النووي المربوطة بالسطح ، وأثناء مراقبة صورة المجال الساطع ، ضع تركيز شعاع التلاعب فوق الكريات المجهرية غير الممتدة قليلا عن طريق ضبط التلسكوب ، ثم اضبط موضع المرحلة حتى يتم محاصرة أحد الكريات المجهرية. ضع الكرة المجهرية تقريبا في وسط المستوى XY للمصيدة البصرية ، وقم بإنشاء سلسلة من الموجات المربعة في عرض المختبر وأرسلها إلى A OD لتشغيل شعاع الليزر وإيقاف تشغيله بشكل متكرر.

شاهد الكرة المجهرية أثناء تشغيل المصيدة وإيقاف تشغيلها بشكل متكرر. ولاحظ ما إذا كان الليزر يحفز أي اتجاه تفضيلي لحركة الكريات المجهرية أثناء ضبط موضع الكرة المجهرية بشكل متكرر في كل من الاتجاه X و y. من خلال التحكم في مرحلة البيزو ، يجب أن تصبح الحركة العشوائية للكرة المجهرية متناحية، على الرغم من أنها مقيدة بشكل ملحوظ عند تشغيل الليزر.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة الخرزة في الاتجاه Z. مرة أخرى ، قم بتشغيل وإيقاف تشغيل شعاع الليزر. بينما هذه المرة قياس الإزاحة المحورية للكريات المجهرية في الوقت الفعلي.

قم بتوسيط المرحلة داخل المنطقة الخطية ، وهي النقطة التي يكون فيها إزاحة Z أكبر لتمديد منحدر الحمض النووي ، شدة الليزر عن طريق إرسال إشارة جهد إلى A OD من صفر فولت إلى 0.5 فولت بخطوات 0.025 فولت في كل خطوة. سجل 400 إطار بمعدل 100 إطار في الثانية وقم بمتوسطها للحصول على الإزاحة المحورية. أخيرا ، ارسم منحنيات تمديد القوة وقم بتناسبها مع نموذج سلسلة معدل يشبه الدودة.

كما هو موضح هنا منحنيات تمديد القوة لتسلسلات NA ثنائية الأبعاد ، و 1 ، 298 زوجا أساسيا و 247 زوجا أساسيا في الطول لفترات قصيرة من الحمض النووي. لا تشرح السلسلة التقليدية الشبيهة بالديدان أو نموذج WLC بشكل كامل علاقة امتداد القوة لأنه في مقاييس الطول هذه ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار تأثيرات الحجم المحدود وامتداد القوة الصفرية الناجم عن قيود الحدود. لذلك يجب أن تكون قياسات تمديد القوة ملائمة باستخدام نموذج WLC المعدل ، والذي له طول ثبات فعال وامتداد قوة صفرية كمعلمات ملائمة موصوفة بمزيد من التفصيل في المواد التكميلية.

بالنسبة لأطوال الكنتور الكبيرة ل D-S-D-N-A ، فإن طول الثبات الفعال هو ببساطة طول الثبات الاسمي حوالي 50 نانومتر ، ويمكن إهمال امتداد القوة الصفرية من نوبات WLC المعدلة. أطوال الثبات الفعالة هي 35 نانومتر لزوج القاعدة 1 ، 298 ، الحمض النووي و 25 نانومتر ل 247 زوج أساسي من الحمض النووي بعد تطويره. مهدت هذه الطريقة الطريق لمجموعة من القياسات الميكانيكية النانوية على مجمعات بروتين الحمض النووي والحمض النووي ، بما في ذلك دراسة حركية تكوين وانهيار حلقات الحمض النووي بوساطة البروتين التنظيمي.