Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este vídeo demonstra um protocolo para isolamento e caracterização fenotípica de progenitores hematopoéticos usando separação baseada em esferas magnéticas e fornecimento de células ativadas por fluorescência. Primeiro, a perna traseira, o fêmur, a tíbia e a medula espinhal são dissecados de um camundongo e homogeneizados para gerar uma suspensão de células da medula óssea. A população é então enriquecida para células que expressam o kit C usando fluxo de microesferas magnéticas.

A análise citométrica da população enriquecida demonstra que este método produz linhagem hematopoiética altamente purificada, progenitores e células-tronco hematopoiéticas, que podem então ser usadas para estudos funcionais in vitro e in vivo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a lavagem óssea, é que ela permite uma recuperação mais eficiente e rápida das células da medula óssea. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia ou diagnóstico de inflamação, autoimunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, distúrbios metabólicos e modelos imunes ao câncer, pois permite a caracterização fenotípica e a análise funcional ex vivo de progenitores hematopoiéticos.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre o monitoramento da hematopoese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Também pode ser usado para estudar a transação de sinal de biologia celular e a expressão gênica regulada pelo desenvolvimento em subconjuntos distintos de progenitores. Comece colocando um rato sacrificado em uma panela de aço inoxidável.

Pulverize o abdômen e as costas com etanol 70% para coletar os ossos que serão usados como fonte de células. Use uma tesoura para fazer duas pequenas aberturas na pele nas patas traseiras com a ajuda de uma pinça, desloque o fêmur, vire o mouse de cabeça para baixo e corte a pele longitudinalmente. Para exibir a coluna vertebral, remova a coluna vertebral.

Em seguida, usando uma tesoura de ponta afiada. Remova cuidadosamente todos os resíduos de tecidos moles da coluna vertebral. Use gaze para remover resíduos de tecidos moles do fêmur e da tíbia.

Em seguida, coloque os ossos em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de RPMI suplementado. Média. Coloque vários filtros estéreis de quatro quintos em uma argamassa estéril. Em seguida, usando uma pinça, transfira os ossos para a argamassa e cubra-os com outra camada de filtros para montar uma superfície de fricção.

Em seguida, coloque um filtro de célula de 40 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, usando um pilão, esmague os ossos até obter uma suspensão celular homogênea. E usando uma pipeta, transfira a suspensão para o filtro de células.

Em seguida, adicione cinco mililitros de RPMI suplementado fresco à argamassa para lavar e colher as células restantes pipetadas para cima e para baixo. Em seguida, adicione o RPMI ao tubo com o filtro. Repita os dois últimos pontos até que os ossos homogeneizados pareçam claros.

Depois que a solução passar pelo filtro, transfira-a para um novo tubo de 50 mililitros e filtre e repita o processo para eliminar os restos de tecido restantes. Centrif. Use o tubo a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o supinato por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet da célula.

O próximo passo do procedimento é caracterizar os fenótipos dos progenitores hematopoiéticos. Comece suspendendo o palato celular de cada camundongo em 15 mililitros de PBS e 2% de FBS. Em seguida, centrifugar o tubo a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remover cuidadosamente o supinato por aspiração.

Não perturbe o pellet. Reese dobrou o pellet em cinco mililitros de PBS e 2% FBS e contou as células usando um hemocitômetro. Uma vez determinada a concentração celular, transfira um centavo de tempo das seis células para cada poço sobre uma placa inferior redonda de 96 poços.

Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante cinco minutos. Durante a centrifugação, prepare uma mistura de anticorpos monoclonais direcionados contra os marcadores de superfície listados aqui em PBS e 2% FBS para corar as células. Assim que a centrifugação for concluída, descarte o supinato invertendo a placa e adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos a cada poço.

Em seguida, usando uma pipeta de pipeta multicanal para cima e para baixo para dissociar em suspensões de célula única. Incubar as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação, lavar as células duas vezes com 150 microlitros de PBS e 2% de FBS. Em seguida, centrifugue a placa a 500 vezes G durante cinco minutos.

Em seguida, descarte o sene invertendo o prato. Em seguida, adicione 50 microlitros de um a 300 AP três tamanho sete strept adin diluído em PBS com 2% FBS para cada poço dissociado em suspensão de célula única por pipetagem. Incube as células por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação.

Lave as células duas vezes com 150 microlitros de PBS e 2%FBS Depois de centrifugar a placa para ganhar, descarte o sobrenadante S e ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS e 2%FBS, analise as amostras por citometria. Em seguida, para classificar subconjuntos selecionados de células hematopoéticas, o enriquecimento magnético é realizado na medula óssea para enriquecer as células positivas secretas. Reeses gasta o amigo celular de medula óssea derivada de pelo menos 10 camundongos em um mililitro de solução tampão contendo anticorpo monoclonal C kit conjugado a um PC diluído de um a 50.

Incube as células por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação. Lave as células duas vezes com 40 mililitros de solução tampão. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o natum supino por aspiração.

Em seguida, adicione 50 microlitros de microesferas anti A PC por mouse diretamente ao pellet. Misture bem e incube por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius após a incubação, lave e gire as células como antes. Em seguida, suspenda novamente o pellet celular em quatro mililitros de solução tampão Para cada três camundongos, coloque as colunas LS máximas no campo magnético de um separador máximo adequado.

Prepare as colunas enxaguando com quatro litros de solução tampão. Em seguida, aplique a suspensão celular e colete as células não marcadas que passam em um tubo de coleta. Lave a coluna com fórmula litros de solução tampão três vezes.

Adicione um novo buffer quando o reservatório da coluna for esvaziado. Uma vez que toda a solução tenha fluído através do fluxo de descarte, remova as colunas do separador e coloque cada uma em cima de um tubo cônico de 15 mililitros. Pipetar quatro mililitros de solução tampão em cada coluna e lavar imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando o êmbolo para dentro da coluna.

Centrifugar os tubos a 500 vezes G durante cinco minutos. Remova cuidadosamente o SUP natum por aspiração. Ressuspenda cada pellet com um mililitro de solução tampão e agrupe os pellets em um único tubo cônico de 15 mililitros.

Uma vez que a população de células positivas do kit marinho tenha sido enriquecida, core e classifique as células por fatos. Progenitores hematopoiéticos e células-tronco hematopoiéticas de uma suspensão de medula óssea enriquecida para células positivas do kit sea usando esferas magnéticas e LT, HSC e THSC foram classificados de acordo com a expressão de moléculas de superfície, conforme descrito neste vídeo. Esta figura mostra um exemplo do procedimento de gating eletrônico para pontuar progenitores linfóides comuns como linina.

Veja-o baixo interleucina sete células R positivas. Lin menos vê-lo cicatriz positiva um positivo e linin ver kit cicatriz positiva um. Células baixas do kit SEE marcha positiva.

Os progenitores mielóides comuns são identificados como células positivas para FC gamma R.Low CD 34. Também do kit C, os progenitores positivos de monócitos granulócitos de marcha são identificados como FC gama, são células positivas de CD 34 alto e progenitores de eritrócitos de megacariócitos são identificados como gama de FC, são células negativas de CD 34 baixas do LKS, oito células LTHSC e STHSC são identificadas como células CD 34 negativas e CD 34 positivas, respectivamente. Assim, são obtidas duas populações enriquecidas e altamente purificadas que estão fisiologicamente presentes em baixo número para abordar o impacto da autoimunidade nas HSCs de hematopoese de camundongos controle e com doença inflamatória intestinal.

Foram corados com anticorpo KI 67 e DPI como pode ser visto aqui. As células cíclicas são mal, se é que são, detectáveis no compartimento de células-tronco hematopoiéticas negativas LKS CD 34 de controles saudáveis. Em contraste, os mesmos subconjuntos celulares são significativamente aumentados durante a DII e um número substancial de HSCs é detectado nas duas fases M do ciclo celular do SG.

Sugerindo assim que a inflamação crônica mediada por células T determina a entrada de HSCs no ciclo celular. Para avaliar a presença de um TP armazenado em vesículas, células CD 34 negativas de camundongos saudáveis foram coradas com o composto de ligação a nucleotídeos quinino e vermelho nuclear A análise por microscopia confocal de células vivas revela que em HSCs, mas não em GMPs, vesículas positivas quire são visíveis no citoplasma para determinar se as HSCs respondem a A TP extracelular. A resposta de cálcio de células-tronco hematopoiéticas selecionadas carregadas com 4 0 2 e estimuladas com um TP e micina iônica foi analisada como visto aqui. Traços de elevação de cálcio de célula única indicam que houve um aumento no cálcio citosólico em LT HSC pela ativação de receptores P dois anérgicos puros.

Após a exposição a um TP, uma vez que as elevações citosólicas do cálcio induzem a liberação de PT A vesicular. Este experimento sugere que um TP pode regular sua própria liberação de HSCs e demonstra que esse procedimento pode ser usado para estudos funcionais de HSCs. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco do topo do neurônio e progenitores comprometidos com a linhagem para ensaios funcionais. Após este procedimento, outros métodos, como a reconstituição de camundongos receptores não erradiados, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o potencial de reconstituição de células-tronco hematopoiéticas purificadas do estado C ou do ambiente inflamatório.