Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

El objetivo general de este procedimiento es aislar los ácidos nucleicos listos para PCR y las proteínas inmunorreactivas de una muestra sin necesidad de electricidad o infraestructura de laboratorio. El aislamiento de los ácidos nucleicos en las proteínas comienza mezclando la muestra con guina y tiocianato para piojos de la muestra y pasando la mezcla sobre el sorbente en la pipeta de extracción. Cinco veces después del quinto y último paso sobre el sorbente, coloque la mezcla en la extracción de proteínas, tampón y reserve para aislar la proteína inmunorreactiva.

A continuación, el sorbente y los ácidos nucleicos unidos se lavan pasando etanol al 95% sobre el sorbente. En numerosas ocasiones, el sorbente y los ácidos nucleicos unidos se secan haciendo pasar aire ambiente sobre el sorbente durante cinco minutos. El paso final para el aislamiento de ácidos nucleicos listo para PCR es aludir los ácidos nucleicos del sorbente utilizando 250 microlitros de tris u otra solución acuosa similar para el aislamiento de la proteína inmunorreactiva.

Después de mezclar la muestra y el tampón de extracción de proteínas, utilice una segunda pipeta de extracción y pase la mezcla sobre el sorbente 15 veces. El siguiente paso es lavar el sorbente con proteínas unidas pasando etanol al 95% sobre el sorbente varias veces. A continuación, el sorbente y la proteína unida se secan haciendo pasar aire ambiente sobre el sorbente durante cinco minutos.

El paso final del protocolo es eluir la proteína del sorbente. En última instancia, la pipeta de extracción utilizada en este procedimiento permite el aislamiento sin electricidad de los ácidos nucleicos listos para PCR y las proteínas inmunorreactivas. Hola, mi nombre es Dave Pawlowski.

Soy un científico investigador senior en Kubrick Incorporated en Buffalo, Nueva York, y hoy aprenderemos una técnica que aislará tanto las proteínas como los ácidos nucleicos en línea sin la necesidad de una centrífuga o un vórtice o cualquier otro equipo de laboratorio extraño antes de la lisis de la muestra. Asegúrese de que las muestras estén en forma líquida. Si la muestra es sólida, por ejemplo, alimentos o heces, la muestra debe suspenderse en un medio líquido como agua o solución salina tamponada con fosfato.

Mezclar 500 microlitros de la muestra con 500 microlitros de tiocianato de guina seis molares en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, presione la bombilla de una pipeta de extracción, expulsando el aire ambiente. Tire de toda la muestra de un mililitro en la pipeta de extracción sobre el material absorbente permitiendo que el bulbo se expanda lentamente.

Invierta la herramienta de extracción de modo que las perlas de sorbente y la muestra se drenen en el bulbo. Muele las perlas de sorbente con la muestra en la bombilla. Teniendo cuidado de no expulsar la muestra fuera de la pipeta de extracción.

Invierta la pipeta de extracción y expulse la muestra en el tubo original de 1,5 mililitros. Introduzca toda la muestra de un mililitro en la pipeta de extracción, pasando por encima del sorbente a una velocidad moderada. Teniendo cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción, expulse toda la muestra en el tubo de 1,5 mililitros presionando la pera.

Repita este proceso, pasando la muestra sobre el sorbente cuatro veces más para un total de cinco pasadas. Después de la quinta pasada sobre el sorbente, expulse toda la muestra de un mililitro en cuatro mililitros del tampón de extracción de proteínas en un tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle el tubo por inversión, luego cierre el tubo y déjelo a un lado para más tarde. Uso.

Lave los ácidos nucleicos aislados pasando un mililitro de etanol al 95% sobre el sorbente tres veces, devolviendo el etanol a su tubo original. Al paso final, repita el lavado tres veces con un segundo mililitro de lavado con etanol al 95%. El siguiente paso del procedimiento es secar el sorbente, la recuperación de ácido nucleico se realiza mejor cuando el sorbente está seco.

Sé que este paso es tedioso. Sin embargo, si completa este paso en el período de tiempo recomendado, sus resultados serán mejores. Presione y suelte la bombilla durante cinco minutos.

Al pasar el aire ambiente por toda la pipeta de extracción para secar los ácidos nucleicos y el lecho sorbente, limpie el etanol residual de la punta de la pipeta de extracción. Con una toallita Kim, recupere los ácidos nucleicos pasando 250 microlitros de 10 milimolares sobre el sorbente cinco veces. El tampón triss puede sustituirse por cualquier otra solución acuosa adecuada, como el PBS.

La solución resultante contiene los ácidos nucleicos extraídos para realizar la extracción de proteínas primero, mezcle la muestra en el tampón de extracción de proteínas que se reservó previamente invirtiendo el tubo pasa aproximadamente de dos a tres mililitros de esta muestra de cinco mililitros sobre el sorbente de una nueva extracción. La pipeta expulsa toda la muestra en el mismo tubo cónico de 15 mililitros. Tenga cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción.

Repite este proceso. Pasar la muestra sobre el sorbente 15 veces. Lave el sorbente y la proteína unida pasando un mililitro de etanol al 95% sobre el lecho absorbente tres veces, expulsando el etanol en su tubo de lavado original tres veces más usando un segundo mililitro de lavado con etanol al 95%.

El siguiente paso del procedimiento es volver a secar el sorbente. Al igual que con los ácidos nucleicos, la recuperación de proteínas se realiza mejor cuando el sorbente se seca. Durante un período de tiempo más largo.

Presione y suelte la bombilla durante cinco minutos, haciendo pasar el aire ambiente por toda la pipeta de extracción. Para secar el lecho absorbente de proteínas, limpie el etanol residual de la punta de la pipeta de extracción. Con una toallita Kim, recupere la proteína pasando 250 microlitros de PBS sobre el sorbente cinco veces.

El tampón PBS puede sustituirse por cualquier otra solución acuosa adecuada, como tris de 10 milimolares, pH 6,8. La solución resultante contiene el contenido de proteínas de la muestra. Los genes de la toxina shiga asociados con la entero hemorrágica e coli oh 1 5 7 H siete cepas E DL 9 33 se amplificaron a partir de un procedimiento de extracción de proteínas de ácidos nucleicos utilizando la pipeta de extracción.

Los genes de la toxina shiga, la toxina Shiga uno y la toxina shiga dos se encuentran en el fago de bacterias lambda templadas y en el fago de bacterias defectuosas bajo el control del promotor PR. La activación de la respuesta SOS en E. coli conduce a la profagia en la inducción y/o producción de toxinas. En este caso, hay un gran aumento en la amplificación del gen de la toxina del azúcar dos cuando la respuesta SOS es inducida por la mitomicina C en comparación con el control no tratado.

Esto sugiere la inducción de profagos y la replicación del genoma del fago. La proteína recuperada de los experimentos de aislamiento de proteínas de ácidos nucleicos descritos en el video es inmunorreactiva. La fracción proteica aislada se aplicó a las tiras de ensayo de flujo lateral de E. coli O 1 57 de control rápido.

Los controles muestran una identificación positiva en todas las muestras que albergan E. coli oh 1 5 7 con o sin inducción de shiga toin, como se visualiza por la presencia de dos bandas rojas. Los datos también muestran resultados positivos para aquellas muestras que albergan E. coli oh 1 5 7 que se procesaron para ácidos nucleicos y proteínas utilizando la pipeta de extracción. Estos datos muestran que la proteína aislada de cada muestra es inmunoactiva, lo que desencadena una respuesta positiva.

La proteína aislada es adecuada para la electroforesis, como se muestra aquí en un gel de acrilamida al 8% teñido con kumasi cargado con BSA aislado de isotiocianato de gudina de seis molares. Utilizando la extracción, la pipeta y el protocolo asociado, la movilidad electroforética de la proteína aislada es idéntica a la de las muestras de control. Una vez dominada, puedes realizar esta técnica en menos de 20 minutos.

Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo aislar proteínas y ácidos nucleicos del dispositivo simple. Gracias por tomarse el tiempo de ver nuestro video.