Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel C. elegans

L'obiettivo generale di questo video è quello di dettagliare lo sviluppo e l'implementazione di una lettura molecolare dell'adattamento olfattivo a lungo termine nell'elgano marino che descrive lo stato di adattamento di un animale. Ciò si ottiene marcando una proteina chinasi G chiamata uovo L quattro con una molecola proteica fluorescente verde ed esprimendo questa fusione proteica nelle cellule dell'ala dell'anfifi, nei neuroni WC di tipo C o A come secondo passo, gli animali che esprimono la forma marcata GFP dell'uovo L quattro nei neuroni A WC sono coltivati su piastre di terreno di crescita di nematodi contenenti la fonte di cibo batterica OP 50. Successivamente, dopo quattro giorni, una popolazione di animali viene lavata via dalle piastre di coltivazione ed esposta a un odore percepito da un WC A per 80 minuti al fine di promuovere l'adattamento olfattivo a lungo termine.

I risultati mostrano una localizzazione nucleare dell'uovo L quattro marcato con GFP nel WC A di animali adattati rispetto a una posizione citoplasmatica di ALE marcato GFP quattro di animali di controllo non adattati Creando una copia funzionale dei quattro campi ALE, la proteina fluorescente verde due. Possiamo tracciare la localizzazione subcellulare di ACO four in A WC e descrivere lo stato comportamentale dell'animale in base alla localizzazione GFP. Questo strumento molecolare ci consente di studiare rapidamente il ruolo di vari mutanti o trattamenti nel modellare l'output cellulare dopo una stimolazione neuronale sostenuta.

Il presente protocollo inizia con la costruzione di uova L quattro che esprimono l'uovo marcato GFP, come descritto nella procedura scritta che accompagna il presente video. La linea integrata finale è indicata come I come 500 e la molecola dell'uovo L quattro etichettata GFP come uovo L quattro GFP coltiva gli animali IS 500 a 25 gradi Celsius su piastre NGM standard da 10 centimetri. Seduti con i batteri OP 50 E coli il primo giorno, scegli da quattro a cinque da 500 animali al quarto stadio larvale da piastre coltivate a 25 gradi Celsius su piastre da 10 centimetri op 50 E coli seminate utilizzando un piccolo filo di platino denominato plettro per raccogliere e trasferire gli animali.

Ripetere l'operazione per altri quattro piatti. Incubare le piastre a 25 gradi Celsius il quarto giorno. Lavare le popolazioni adulte di animali IS 500 dalle grandi piastre NGM aggiungendole come tampone basale alla piastra e facendole roteare delicatamente.

Questo rimuove gli animali dalla superficie della piastra e nella soluzione tampone. Utilizzando pipette di vetro usa e getta, aspirare gli animali dalla piastra e trasferirli in una provetta da 1,5 millilitri. Iniziare i saggi di traslocazione lavando i 500 animali in s basilico per rimuovere i batteri non centrifugare.

Animali tra un lavaggio e l'altro. Piuttosto, lasciare che gli animali si stabiliscano per gravità in una provetta da microcentrifuga stazionaria da 1,5 millilitri. È fondamentale assicurarsi che tutti i batteri vengano rimossi e che le piastre NGM siano prive di contaminazione, poiché i batteri residui influenzeranno negativamente l'esito del test di traslocazione.

Ripetere il lavaggio con basilico due volte. Preparare la soluzione di adattamento aggiungendo 100 millilitri di tampone di basilico S a un cilindro graduato da 100 millilitri. Se si esegue l'adattamento aldeidico, aggiungere 7,5 microlitri di aldeide a 100 millilitri di basilico ESP sigillare il cilindro utilizzando una striscia di param.

Capovolgere delicatamente il cilindro graduato contenente come basilico e odorare 30 volte. Per creare un'emulsione uniforme, aggiungere animali a ciascun tubo cercando di mantenere un numero di animali compreso tra 100 e 200 in ogni tubo. Con un po' di pratica, è possibile stimare il numero approssimativo di animali in un palato a occhio dopo che gli animali si sono sistemati.

Dopo il lavaggio al basilico S, rimuovere tutto il liquido dall'etichetta del tubo epi orph un nuovo tubo positivo e l'altro nuovo tubo come negativo. Quindi aggiungere un millilitro della miscela di adattamento alla provetta della microcentrifuga ad adattamento positivo e aggiungere un millilitro di basilico S alla provetta della microcentrifuga di controllo negativa non adattata. Posizionare una protezione del tappo della provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri su ciascuna provetta e posizionare le provette su un rotatore per 80 minuti.

Dopo 80 minuti, lavare gli animali tre volte nel basilico S, lasciando che gli animali si stabilizzino per gravità tra un lavaggio e l'altro. Realizzare tamponi al 2%aros contenenti cinque millimolari di azoturo di sodio sciogliendo l'elettroforesi su gel aros. In acqua distillata, posizionare una singola goccia di mol e aros contenenti azoturo di sodio su un vetrino da microscopio posizionare immediatamente un altro vetrino da microscopio sul primo vetrino per appiattire la goccia di agros fuso.

Lasciare agire per 30 secondi e poi separare delicatamente i vetrini del microscopio, lasciando un vetrino da microscopio con un tampone piatto di circa un millimetro. A questo punto, è imperativo che ogni sperimentatore escogiti una chiave per tenere traccia di quali diapositive sono l'esperimento positivo e quali diapositive sono il controllo negativo. Quindi, dopo che i vermi si sono depositati dal lavaggio finale, rimuovere tutto il liquido dal basilico, quindi aggiungere gli animali goccia a goccia sui cuscinetti aros di diversi vetrini da microscopio.

È importante mantenere il numero di animali per scivolo tra 50 e 100. Troppi animali per diapositiva complicano il punteggio e spesso creano un bagliore dispersivo. Dopo l'eccitazione della luce blu, il liquido in eccesso può essere espulso dal tampone aros utilizzando una piccola salvietta kim.

Posiziona un vetrino da 0,5 millimetri sul tappetino e lascia riposare per due minuti per consentire all'azide di sodio di immobilizzare gli animali. Quindi, passa i vetrini a un'altra persona che segnerà alla cieca il modello di localizzazione GFP uovo L quattro. Questo controllerà per qualsiasi esperimento o punteggio di distorsione tra 50 e 100 animali per vetrino utilizzando un microscopio fluorescente verticale con obiettivi di ingrandimento 10 x 40 x e 63 x e filtri G-F-P-R-F-P.

Innanzitutto, localizza gli animali con un ingrandimento inferiore a 10x utilizzando l'illuminazione a campo chiaro. In secondo luogo, localizzare il neurone A WC disattivando l'illuminazione del campo chiaro e utilizzando il filtro RFP. L'odore del promotore.

Un rosso DS guida l'espressione in un neurone WB e A WC. I neuroni A WC hanno corpi cellulari di forma ovale distintivi rispetto ai corpi cellulari WB, che sono più piccoli e di forma circolare. Una volta individuato il corpo cellulare A WC, passare al filtro GFP e registrare la localizzazione dell'uovo GFP L 4 come nucleare o citoplasmatico.

L'uso di un contatore consente allo sperimentatore di continuare a guardare nell'oculare mentre segna il vetrino. Questo processo viene ripetuto almeno tre volte in giorni separati per produrre dati statisticamente significativi. Un esempio del modello di localizzazione dell'uovo GFP L 4 nel WC A prima e dopo l'esposizione prolungata agli odori è mostrato prima dell'esposizione prolungata agli odori.

L'uovo GFP L 4 è localizzato nel citosol del WC A dopo 80 minuti di esposizione all'odore. L'uovo quattro della GFP è localizzato nel nucleo del WC A a livello comportamentale. Gli animali con uovo CITOSOLICO GFP quattro in un WC sono attratti da una fonte puntiforme di odore.

Questo grafico è stato generato dai risultati rappresentativi dei test di chemiotassi di animali non adattati. Si noti che l'indice CHEMOTAXIS è vicino a uno. Gli animali che esibiscono il G-F-P-E-L nucleare quattro nel WC A non sono attratti da una fonte puntiforme dell'odore di adattamento.

Questo grafico è stato generato dai risultati rappresentativi dei test CHEMOTAXIS di animali adottati. Si noti che l'indice CHEMOTAXIS è vicino allo zero. Una volta che l'uovo L 4 entra nel nucleo dei neuroni A WC, provoca cambiamenti stabili e duraturi nella fisiologia A WC che persistono anche quando l'uovo L 4 non è più nel nucleo.

Dopo 80 minuti di esposizione agli odori, gli animali ignoreranno una fonte puntuale dell'odore di adattamento e questo adattamento persisterà anche dopo 120 minuti di recupero. Dopo 80 minuti di esposizione agli odori. GFP Egle four è stata osservata nel nucleo del WC A. L'ingresso di questa NU nucleare è necessario e sufficiente per indurre un adattamento a lungo termine nel WC A. Dopo 120 minuti di recupero, questi animali non esibiscono più la GFP nucleare Eagle quattro, ma continueranno a ignorare una fonte puntiforme dell'aldeide odorosa di adattamento a livello comportamentale, esclusi i tempi di coltivazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente.