일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

다음 실험의 전반적인 목표는 Hamilton Star Liquid 핸들링 워크스테이션의 진정한 팁 추출 기술을 사용하여 인간 유전체, DNA를 전혈에서 분리하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 혈액 샘플, 용해 완충액, 단백질 분해 효소 K 및 에탄올로 구성된 용액의 세포를 흡인하고 트루 팁을 통해 여러 번 분배하여 DNA를 트루 팁 매트릭스에 결합합니다. 다음으로 두 개의 별도 세척 버퍼가 결합된 핵산에서 잔류 단백질, 용해, 완충액 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 트루 팁을 통해 흐릅니다.

세 번째 단계에서는 트루 팁의 결합 매트릭스를 여러 번 흡입 및 분주하여 건조하여 남아 있는 세척 버퍼를 증발시키고, 최종 단계에서 착시 버퍼는 결합 매트릭스를 가로질러 앞뒤로 흐르면서 매트릭스에서 DNA를 방출합니다. 따라서 트루 팁 기술을 사용하여 오염 물질이 없는 고분자량 게놈 DNA를 추출하고 UV vis 흡광도, 겔 전기영동 및 정량적 PCR 또는 염기서열분석을 통해 확인할 수 있습니다. 스핀 컬럼 또는 자성 입자를 기반으로 하는 다른 시료 전처리 방법에 비해 True Tip의 장점은 Tru Tip이 자동화가 쉽다는 것입니다.

원심분리기와 마그네틱 로드가 있는 값비싼 시스템이 필요하지 않으며 간단한 작업 흐름으로 귀중한 데크 공간을 절약할 수 있습니다. 오늘은 전혈에 대해 집중적으로 설명하겠습니다. Tru Tip은 임상 면봉 샘플의 바이러스 RNA 또는 플라즈마에서 cell-free DNA의 분리뿐만 아니라 다른 게놈 DNA 샘플 응용 분야에 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 Hamilton Liquid Handling 워크스테이션에서 Truet 팁 추출 절차 개발에 중요한 역할을 한 당사 실험실의 자동화 엔지니어인 Dane Brady가 시연할 것입니다.

이 프로토콜에서 Hamilton Star Liquid 핸들링 로봇은 96개의 전혈에서 DNA를 동시에 추출합니다. Hamilton Star의 갑판에는 히터 셰이커 장치(옵션)가 있으며, 이는 전혈과 같은 특정 임상 매트릭스의 효소 분해에 중요합니다. 이 시스템에는 96채널 피펫 헤드를 장착할 수 있기 때문에 각 실제 팁 단계 및 시약을 위한 전용 96웰 플레이트가 있습니다.

먼저 Hamilton Star 로봇 관련 장비와 컴퓨터의 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어에서 Hamilton Run Control 소프트웨어를 엽니다. ACON에서 제공하는 96개 샘플에 대한 실행 파일을 엽니다.

이제 다이어그램에 따라 스타 데크 레이아웃을 설정합니다. 1밀리리터 필터 팁을 모든 위치에 배치하고, 1은 필터링되지 않은 위치에 2개, 1밀리리터 팁을 위치 3에 배치하고, Conni Hamilton 1밀리리터 LPT는 2mm 트루 팁을 배치합니다. 차트를 계속 참조하여 5개에서 12개까지의 나머지 위치를 필요한 LabWare로 채우되 아직 샘플을 로드하지는 마십시오.

이제 시약 75ml의 용해 및 결합 완충액을 분배합니다. F는 트러프 위치 5에 로드되어야 합니다. 또는 버퍼로 미리 채워진 플레이트를 사용하여 설정을 간소화하고 데크 레이아웃을 단순화할 수도 있습니다.

그에 따라 로봇을 계속 로드합니다. 마지막으로, 혈액 튜브에서 캡을 제거하고 검체 캐리어 랙 또는 데크 위치 4에 놓습니다. 샘플 1을 맨 왼쪽 캐리어의 뒤쪽에 놓고 샘플 96이 전면 오른쪽 위치에서 끝나도록 각 캐리어를 따라 순차적으로 이동합니다.

모든 샘플이 로드되면 실온과 평형을 이루도록 합니다. 프로토콜이 완전히 자동화되어 있기 때문에 운영자 오류가 발생할 가능성이 거의 없습니다. 샘플은 랙에 올바른 순서로 배치해야 하지만 적절한 샘플 추적을 보장하기 위해 바코드 를 구현할 수 있습니다.

자동화된 스크립트를 시작하려면 실행 파일 창의 왼쪽 위 모서리에 있는 재생 단추를 선택하고 처리 중인 샘플 수를 입력합니다. 스크립트에 의해 실행되는 첫 번째 단계는 80마이크로리터의 proteinase K를 히터 쉐이커 모듈의 위치 14에 있는 인큐베이션 플레이트로 옮기는 것입니다. 다음으로, 스크립트는 8채널 암을 사용하여 배양 플레이트의 각 샘플 웰에 200마이크로리터의 샘플을 분배합니다.

그런 다음 96 채널 암을 사용하여 600마이크로리터의 용해 완충액 F를 배양 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 그런 다음 스크립트는 용액을 10회 동안 혼합하고 딥 웰 플레이트에서 섭씨 70도 및 500RPM에서 20분 동안 배양하면 온도는 섭씨 60도에 불과하며 이는 단백질 분해 효소 K 활성 범위 내에 있습니다. 샘플이 배양되는 동안 액체 취급 시스템은 벌크 시약 트로프에서 추출 및 용출 시약을 해당 96개의 웰 플레이트로 분배하여 계속 작동하며, 100마이크로리터의 Elucian 버퍼 A가 딥 웰 플레이트의 각 웰에 추가됩니다.

위치 13에서 800마이크로리터의 에탄올이 딥 웰 플레이트의 각 웰에 증착됩니다. 위치 10에서, 1점 6밀리리터의 세척 버퍼 K가 위치 12에서 딥 웰 플레이트의 각 웰에 추가되고, 1.6밀리리터의 세척 버퍼 J가 위치 11에서 딥 웰 플레이트의 각 웰에 추가됩니다. 20분 배양 후, 샘플 혼합물을 배양 플레이트에서 위치 10에서 에탄올이 포함된 딥 웰 플레이트로 옮기고 12번의 피펫팅 주기로 혼합합니다.

이 과정에서 시약 팁은 필요에 따라 쓰레기통으로 버려집니다. 이 프로그램은 용해 공정에서 DNA 추출까지 계속되며, 먼저 갑판 위치 3에서 96개의 트루 팁을 로드합니다. 다음 단계는 10 사이클에 걸쳐 위치 10의 샘플을 흡인 및 분주하여 핵산을 트루 팁 모놀리스에 결합하는 것입니다.

다음으로, 트루 팁은 위치 11로 이동하여 세척 버퍼 J가 모놀리식 위에서 5회 순환되어 잔류 용해, 버퍼 및 샘플 매트릭스를 제거합니다. 그런 다음 트루 팁은 위치 12로 이동하여 세척 버퍼 K가 5번 순환하여 결합된 핵산에서 단백질 및 기타 오염 물질을 제거합니다. 다음으로, 트루 팁은 세척판 위에서 고속으로 80회 순환하여 자연 건조됩니다.

이제 진정한 팁은 엘루시안 버퍼 a가 두 번 순환하여 DNA를 깊은 우물 플레이트로 방출하는 위치 13으로 이동합니다. 이제 트루 팁이 허리 쓰레기통으로 배출됩니다. 이제 프로그램이 완료되었습니다.

기기에서 용리 플레이트를 제거하고 추출된 샘플을 보관 또는 다운스트림 응용 분야를 위해 적절한 튜브로 옮깁니다. 또한 이 프로그램은 최종 샘플을 단 1시간 만에 원하는 튜브 또는 플레이트로 자동 전송하도록 사용자 정의할 수 있습니다. 이 자동화 시스템은 로봇을 사용하여 96개의 혈액 샘플에서 게놈 DNA를 추출했습니다.

45개의 양성 혈액 샘플의 흡광도 프로파일을 45개의 시약 블랭크와 동시에 처리했습니다. 평균 2 개의 60 대 2 80 흡광도 비율은 1.96이었고, 평균 2 개의 60 대 2 30 비율은 1.93으로 1 % aros 젤의 순수한 샘플을 암시했습니다. 무작위 샘플은 최소한의 전단으로 높은 분자량으로 실행되었습니다.

평균 수율은 전혈 200마이크로리터당 약 5마이크로그램의 DNA였습니다. 자동화된 트루 팁 프로토콜을 최적화할 때 유정 간에 교차 오염이 없는지 확인하기 위해 특별한 주의를 기울입니다. Real-Time PCR은 다음과 같이 양성과 음성의 명확한 분리를 보여줍니다.

RNA 추출의 경우, 96개 샘플의 전체 추출을 최소한의 수작업 시간으로 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Hamilton Star Liquid Handling 워크스테이션에서 자동화된 TRU 기술을 사용하여 전혈에서 인간 게놈 DNA를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.