בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל חדריים עובריים. זה מושג על ידי החזרת עובר לדיסקציה. לאחר מכן, הלב נכרת.

האטרי מוסר והחדרים הטחונים מועברים לתמיסת קולגן. לאחר מכן מודגר תרחיף התא הבודד עם נוגדן המזהה את תאי האנדותל. ולבסוף, מגנט משמש לבידוד תאי האנדותל הקשורים לנוגדנים.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות היווצרות שרשרת אנדותל באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הלב וכלי הדם, כגון אילו גורמים מקדמים נדידת אנדותל כלילי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התנהגות תאי האנדותל, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים כגון מיוציטים ופיברובלסטים ביום שלפני ביצוע הדיסקציה בעבודה על מכסה המנוע של תרבית רקמה, שלב את הנוגדן הנבחר עם חרוזי הדינה המתאימים בהתאם להוראות היצרן לנוגדנים נגד CD 31 של חולדות המשמשים כאן.

שלושה מיקרוליטרים של נוגדן מתווספים ל-25 מיקרוליטר חרוזים לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם ב-10 לשבעת החרוזים דוגרים חרוזים בנוגדנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס להכנת ג'ל קולגן ליצירת צינוריות מהירות של תאים מבודדים במכסה תרבית רקמה על קרח. קולגן משולב מים סטריליים מסוג אחד, 10 XM 1 99, וחמש טוחנות נתרן הידרוקסיד. על פי פרוטוקול הטקסט, פיפטה 20 מיקרוליטר של ג'ל הקולגן לבארות של צלחת תרבית רקמות 384 באר.

מניחים את הצלחת בחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מוסיפים 80 מיקרוליטר DMM לכל באר ודוגרים במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הסר את מדיום התרבות וחזור על הכביסה פעמיים נוספות לאחר השטיפה הסופית, הוסף 80 מיקרוליטר של 10% FBS DM לכל באר ודגר למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר המתת חסד של עכבר בהריון מתוזמן ביום העוברי הרצוי. בטכניקה מאושרת והסרת קרן הרחם על פי פרוטוקול הטקסט, מניחים אותה בצלחת פטרי עם XPBS אחד ושוטפים אותה. לאחר שהשקים העובריים נחשפו דרך חתך בקו האמצע בצומת השליה והעובר, חתכו שק עוברי והחזירו את העובר.

הניחו את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS קר והחזירו את קרן הרחם לקרח כדי לשפר את הגישה לדופן החזה כדי להחזיר את העובר. ואם גנוטיפ, חותכים את הזנב ושומרים אותו בצינור על קרח. כשהעובר על גבו חתוך.

פתח את דופן החזה כדי לדמיין את הלב והריאות כדי להימנע מחיתוך הלב. בצע חתך אנכי לאורך הצד של כלוב הצלעות ליד ארבע גפיים, ואחריו חתך אופקי בתחתית הצלעות. לאחר מכן משוך בעדינות את דופן החזה כלפי מעלה והחוצה מהדרך למעלה עד ליום העוברי בערך 13.5.

דופן החזה שקופה, מסייעת בהדמיה. בעזרת מלקחיים הרם בזהירות את הלב וחתוך את הכלים שמתחת. אם תרצה, העביר את הלב לכלי נקי כדי לשחרר את הלב מהריאות, חתוך מעל הכלים הגדולים.

לאחר מכן, הפרד והשליך את הפרוזדורים והכלים הגדולים מהחדרים. לאחר מכן בעזרת מספריים, טוחנים את החדרים לחתיכות קטנות ומניחים אותם בכ -500 מיקרוליטר קולגנאז על קרח. כרתו ועבדו את החדרים מהעוברים הנותרים, ואספו כל לב בצינור נפרד.

מניחים את החדרים הטחונים בחום של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה למשך 45 דקות כל 15 דקות, הסר בעדינות את הדגימות ופיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק מכנית את התאים. לאחר הדגירה, העבירו את תמיסת הקולגנאז של החדר דרך מסנן של 70 מיקרומטר כדי להסיר את גושי התאים הנותרים, צנטריפוגה של התאים ב-400 גרם למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט והחליפו בכ-200 מיקרוליטר של 10% FBS בפיפטה DMEM למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את התאים, סובבו את התאים שוב, ולאחר שטיפה שנייה וסיבוב. Resus משהה את התאים ב -50 מיקרוליטר של 10% FBS ב- dmm.

לאחר מכן, הכינו את החרוזים על ידי הנחת צינור הנוגדן והחרוזים על מגנט למשך דקה אחת, שאפו את הסופרנטנט. לאחר מכן הסר את הצינור מהמגנט והוסף כ -100 מיקרוליטר של 10% FBS ב- dmm. החזר את הצינור למגנט למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.

חזור על הכביסה בסך הכל שלוש פעמים לאחר הכביסה הסופית. השעו מחדש את החרוזים המצומדים של הנוגדנים ב-10% FBS ב-DMM לכל דגימת תא, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של החרוזים המצומדים של הנוגדנים. הניחו את מתלי תאי החרוזים בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה למשך 30 דקות במכסה זרימה למינר, הניחו את הדגימות על המגנט למשך דקה אחת, שאפו את הסופרנטנט.

הסר את הצינורות מהמגנט ושטוף עם כ-100 מיקרוליטר של 10% FPS ו-dm. חזור על הפעולה בסך הכל חמש כביסות לאחר הכביסה הסופית. השעו את החרוזים בכ -100 מיקרוליטר DMEM.

הנח את הצינורות על המגנט למשך דקה אחת. הסר את המדיום, ואז הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר של טרום חום, 0.25% נסיעות ב-EDTA, דגר את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות. הנח את הצינורות על המגנט למשך שתי דקות.

לאחר מכן העבירו בזהירות את התא המכיל סופרנטנט לצינורות טריים וצנטריפוגה אותם למשך חמש דקות בטמפרטורה של 400 גרם.לבסוף, לאחר הסרת הסופרנטנט Resus, השעו את התאים ב-80 עד 100 מיקרוליטר של גידול אנדותל, מדיום וצלחת. בצלחת תרבית 96 או 384 מטופלת היטב, בהתאם לתשואה הצפויה, כל זוג חדרים מ-E 14.5 עד E 16.5 עוברים, מניב בדרך כלל 450 עד 600 תאים כפי שמודגם כאן באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל המזהה CD 31. תאי אנדותל בודדו מהחדרים של עוברי יום E 13.5.

כאשר מגדלים אותם על צלחת תרבית לא מטופלת, תאים אלה נשארים מעוגלים ויוצרים תבנית מרוצפת כאשר הם קרובים למפגש. למרות שהתאים יידבקו לצלחות המצופות בקולגן מדולל, תאים אלה שבודדו מחדרי E 18.5 יוצרים פחות שרשראות מאשר כאשר הם מצופים בג'ל קולגן. נוסף על כך, התאים יוצרים מהר יותר אינטראקציות בין תאי התאים ויוצרים שרשראות, הענף של ג'ל הקולגן לעומת הצלחת המצופה קולגן, כאימות לזהותם.

התאים באיור זה מתויגים באופן חיובי עם סמן האנדותל ISO selectin. בנוסף, כפי שמוצג כאן, תאי אנדותל שבודדו מחדרי E 18.5 מסומנים באופן חיובי עם סמני האנדותל, PAM ו-flick one. איור זה מציג תאי אנדותל שבודדו מהחדרים של עובר E 14.5 וסומנו עם ציטו הצבע הספציפי לאנדותל.

16 תאים מבודדים שורדים עד תרבית אחת מוחלשת, אך עמידים בפני איזציה ולכן מתאימים ביותר לניסויים סופניים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש וחצי שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות כגון מבחני יצירת צינורות ומבחני נדידת טרנסוול כדי לקבוע כיצד תאים מבודדים אלה מתנהגים במבחנה.