Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik ventriküler endotel hücrelerini izole etmektir. Bu, önce diseksiyon için bir embriyonun alınmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kalp eksize edilir.

Çıkarılan atriler ve kıyılmış ventriküller bir kollajen çözeltisine aktarılır. Tek hücreli süspansiyon daha sonra endotel hücrelerini tanıyan bir antikor ile inkübe edilir. Ve son olarak, antikora bağlı endotel hücrelerini izole etmek için bir mıknatıs kullanılır.

Sonuçta, parlak alan mikroskobu ile endotel zincir oluşumunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, koroner endotel göçünü hangi faktörlerin teşvik ettiği gibi kardiyovasküler gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem endotel hücre davranışı hakkında bilgi sağlayabilse de, miyositler ve fibroblastlar gibi diğer hücre tiplerine de uygulanabilir Diseksiyonu gerçekleştirmeden bir gün önce, bir doku kültürü başlığında çalışarak, burada kullanılan sıçan anti CD 31 antikoru için üreticinin talimatlarını izleyerek tercih edilen antikoru uygun dyna boncukları ile birleştirin.

10'da 1.5 mikrogramlık bir son konsantrasyon için 25 mikrolitre boncuğa üç mikrolitre antikor eklenir, yedi boncuk boncukları gece boyunca dört santigrat derecede antikorda inkübe eder, böylece kollajen jelleri hazırlamak için kollajen jelleri hazırlamak için izole edilmiş hücrelerin buz üzerinde bir doku kültürü davlumbazında. Kombine kollajen tipi bir steril su, 10 XM 1 99 ve beş molar sodyum hidroksit. Metin protokolüne göre, 20 mikrolitre kollajen jelini 384 oyuklu bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına pipetleyin.

Plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her oyuğa 80 mikrolitre DMM ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Kültür ortamını çıkarın ve son durulamadan sonra yıkamayı iki kez daha tekrarlayın, her bir oyuğa 80 mikrolitre% 10 FBS DM ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İstenilen embriyonik günde zamanlanmış bir hamile fareye ötenazi yaptıktan sonra. Onaylanmış bir teknik kullanarak ve rahim boynuzunu metin protokolüne göre çıkararak, bir XPBS ile bir Petri kabına yerleştirin ve durulayın. Embriyonik torbalar, plasenta ile bir embriyonun birleştiği yerde bir orta hat kesisi ile açığa çıktıktan sonra, bir embriyonik torbayı kesin ve embriyoyu alın.

Embriyoyu soğuk PBS'li ikinci bir Petri kabına yerleştirin ve göğüs duvarına erişimi iyileştirmek için uterus boynuzunu buza geri getirin ve embriyoyu kapitate edin. Ve genotipleme yapıyorsanız, kuyruğu kesin ve buz üzerinde bir tüpte saklayın. Embriyo sırtında kesilmiş.

Kalbi kesmekten kaçınmak için kalbi ve akciğerleri görselleştirmek için göğüs duvarını açın. Göğüs kafesinin yan tarafı boyunca dört uzuvun yakınında dikey bir kesim yapın, ardından kaburgaların alt kısmı boyunca yatay bir kesim yapın. Daha sonra göğüs duvarını yavaşça yukarı çekin ve yaklaşık embriyonik gün 13.5'e kadar yukarı doğru çekin.

Göğüs duvarı şeffaftır ve görselleştirmeye yardımcı olur. Forseps kullanarak, kalbi dikkatlice kaldırın ve aşağıdaki damarları kesin. İstenirse, kalbi akciğerlerden kurtarmak için kalbi temiz bir tabağa aktarın, büyük damarların üzerinde kesin.

Daha sonra, kulakçıkları ve büyük damarları ventriküllerden ayırın ve atın. Daha sonra makas kullanarak ventrikülleri küçük parçalara ayırın ve buz üzerine yaklaşık 500 mikrolitre kollajenaz içine yerleştirin. Kalan embriyolardan ventrikülleri kesin ve işleyin, her kalbi ayrı bir tüpte toplayın.

Kıyılmış ventrikülleri 45 dakika sallanarak 37 santigrat dereceye yerleştirin Her 15 dakikada bir, numuneleri nazikçe çıkarın ve hücreleri mekanik olarak ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. İnkübasyondan sonra, kalan hücre kümelerini çıkarmak için ventrikül kollajenaz çözeltisini 70 mikrometrelik bir filtreden geçirin, hücreleri 10 dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri yeniden askıya almak için DMEM pipetinde yukarı ve aşağı yaklaşık 200 mikrolitre% 10 FBS ile değiştirin, hücreleri tekrar döndürün ve ardından ikinci bir yıkama ve sıkma işleminden sonra. Resus, hücreleri dmm'de 50 mikrolitre% 10 FBS'de askıya alır.

Daha sonra, önce antikor ve boncuk tüpünü bir dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirerek boncukları hazırlayın, süpernatanı aspire edin. Daha sonra tüpü mıknatıstan çıkarın ve dmm'ye yaklaşık 100 mikrolitre% 10 FBS ekleyin. Tüpü bir dakika boyunca mıknatısa geri koyun, ardından süpernatanı çıkarın.

Son yıkamadan sonra yıkamayı toplam üç kez tekrarlayın. Antikor konjuge boncukları DMM'de% 10 FBS'de her hücre örneğine yeniden süspanse edin, beş mikrolitre antikor konjuge boncuk ekleyin. Boncuk hücresi süspansiyonlarını laminer akış başlığına 30 dakika sallanarak dört santigrat dereceye yerleştirin, numuneleri bir dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin, süpernatanı aspire edin.

Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve yaklaşık 100 mikrolitre %10 FPS ve dm ile yıkayın. Son yıkamadan sonra toplam beş yıkama için tekrarlayın. Boncukları yaklaşık 100 mikrolitre DMEM'de askıya alın.

Tüpleri bir dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Ortamı çıkarın, ardından 100 ila 200 mikrolitre ön ısıtma, EDTA'da %0,25 tripler ekleyin, numuneleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte beş dakika inkübe edin. Tüpleri iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.

Daha sonra, süpernatan içeren hücreyi dikkatlice taze tüplere aktarın ve bunları 400 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Son olarak, süpernatan Resus'u çıkardıktan sonra, hücreleri 80 ila 100 mikrolitre endotel büyümesi, ortam ve plaka içinde askıya alın. 96 veya 384 iyi muamele edilmiş bir kültür kabında, beklenen verime bağlı olarak, E 14.5 ila E 16.5 embriyolarından her bir ventrikül çifti, tipik olarak, CD 31'i tanıyan endotelyal spesifik bir antikor kullanılarak burada gösterildiği gibi 450 ila 600 hücre verir. Endotel hücreleri E 13.5 gün embriyolarının ventriküllerinden izole edildi.

İşlenmemiş bir kültür kabı üzerinde büyütüldüğünde, bu hücreler yuvarlak kalır ve birleşime yakın olduklarında bir parke taşı deseni oluşturur. Hücreler seyreltik kollajen ile kaplanmış plakalara yapışacak olsa da, E 18.5 ventriküllerinden izole edilen bu hücreler, bir kollajen jeli üzerine kaplandığından daha az zincir oluşturur. Ek olarak, hücreler daha hızlı hücre hücre etkileşimleri oluşturur ve kimliklerinin doğrulanması için kollajen jel üzerindeki dal ile kollajen kaplı plakaya karşı zincirler oluşturur.

Bu şekildeki hücreler, endotel işaretleyici ISO selektini ile pozitif olarak etiketlenir. Ek olarak, burada gösterildiği gibi, E 18.5 ventriküllerinden izole edilen endotel hücreleri, endotel belirteçleri, PAM ve flick one ile pozitif olarak etiketlenmiştir. Bu şekil, bir E 14.5 embriyosunun ventriküllerinden izole edilen ve endotel spesifik boya sitosu ile etiketlenen endotel hücrelerini göstermektedir.

İzole edilmiş 16 hücre, bir zayıflamış kültüre kadar hayatta kalır, ancak izasyona dirençlidir ve bu nedenle terminal deneyler için en uygun olanlardır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık üç buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, bu izole hücrelerin in vitro olarak nasıl davrandığını belirlemek için tüp oluşturma testleri ve transwell migrasyon testleri gibi diğer testler yapılabilir.