Extracelular Fio Tetrode Gravação em Cérebro de Livremente Andando Insetos

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade neural complexa no cérebro e coordená-la com os comportamentos gravados em vídeo de insetos em movimento livre. Isso é realizado primeiramente pela fabricação de um tetodo flexível de gravação a partir de fios extremamente finos, afiando, testando e revestindo a ponta e o material para marcar sua localização e estabilizar o fio em um tubo de polietileno. O segundo passo consiste em inserir o tetodo de gravação no cérebro, estabilizá-lo com acetato e cera e fixar um laço de alívio de tensão na cabeça.

A seguir, a atividade neural é registrada juntamente com a gravação em vídeo do comportamento locomotor. Sincronize o vídeo com a gravação por meio de um pulso de sincronização para um LED e o amplificador. O passo final consiste em depositar cobre utilizando uma corrente elétrica contínua e intensificar a coloração usando o método Tims para visualizar o local de gravação.

Por fim, técnicas de separação extracelular multicanal de alta densidade identificam unidades neurais, enquanto a análise de vídeos simultaneamente gravados dos comportamentos permite uma correlação fina entre atividade neural e comportamento. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite usar procedimentos existentes para registrar atividade neural extracelular de alta densidade do cérebro de um inseto enquanto este realiza um comportamento complexo. Em seguida, permite identificar onde no cérebro os Tet roads estavam, e tudo isso pode ser feito a um custo relativamente baixo.

Essa técnica pode ajudar a responder perguntas fundamentais em neuropatologia ao correlacionar o momento e a intensidade da atividade neural em regiões cerebrais específicas com o comportamento de um animal em livre movimento. Este método pode fornecer informações sobre o controle sensorimotor, mas também pode ser aplicado a quaisquer comportamentos que exijam insetos em livre movimento, como orientação durante aprendizado ou navegação. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois os eletrodos de gravação são difíceis de preparar, e seu posicionamento e estabilização para gravação exigem técnicas microcirúrgicas muito precisas.

A demonstração visual deste método é fundamental. Os procedimentos de confecção e implante dos eletrodos são difíceis de aprender porque são realizados com materiais muito pequenos e frágeis, e é necessário ter muito cuidado para não danificar o tecido cerebral. Para preparar os fios do Tet Road, coloque dois fios puxados em um dispositivo giratório motorizado de enrolamento.

Enrole o tero em uma direção por dois minutos a 60 rotações por minuto, depois desenrole-o na direção oposta por 30 segundos. Em seguida, use um soprador térmico para fundir os fios, tomando cuidado para não tocar os fios com o equipamento. Realize três passagens para cima e para baixo, vindas de direções alternadas, sendo cada passagem de aproximadamente 10 segundos.

Em seguida, adicione um tubo de suporte feito de um comprimento de 30 centímetros de tubo de polietileno. Insira o tetra lentamente no tubo de suporte para que não entorte. Assim que a extremidade fundida aparecer na outra extremidade do tubo, puxe-a para passar, de modo que haja um comprimento igual de fio em ambas as extremidades do tubo guia.

Agora, segure a ponta separada de cada fio com a pinça, utilizando a base da chama de um bico de Bunsen. Cuidadosamente, queime o revestimento isolante dos últimos dois ou três milímetros de cada fio. Aqueça o fio até que brilhe, mas sem deixá-lo enrolar.

Em seguida, use uma pinça para conectar o tero a um adaptador de soquete IC macho-fêmea que se encaixe no dispositivo de gravação. Insira a extremidade desencapada de cada fio em um soquete diferente do adaptador. Adicione um pino de latão para ajudar a manter os fios no lugar.

Em seguida, utilize uma ponta fina de solda para preencher o soquete com a solda derretida. Depois, teste as conexões elétricas adequadas usando um medidor de impedância conforme descrito no protocolo de texto complementar. Usando um adaptador não utilizado separado, forme um molde pequeno de papel com furos na parte inferior.

Para os pinos de correio, transfira o adaptador em uso para a caixa com o lado do correio na parte inferior e os pinos projetando-se para fora da caixa. Após colar a caixa conforme descrito no protocolo textual, misture rapidamente. Prepare a epóxi de duas partes e despeje-a na caixa.

Para fixar o adaptador e todos os fios, prenda a extremidade próxima do tubo-guia a um lado da caixa com cera dental, mas deixe o tubo aberto de modo que o tero possa ser puxado livremente pelas duas extremidades. Após a epóxi endurecer e o conjunto de vestuário secar, o próximo passo é afiar o tero. Comece cortando a ponta do tero com uma lâmina de bisturi afiada.

Em seguida, polir o tero usando uma ferramenta rotativa pequena montada verticalmente com discos de lixa de grão médio e fino. Configure a ferramenta rotativa para girar em velocidade moderada, segurando o conjunto próximo à sua extremidade. Com pinça, incline a extremidade do conjunto de fios em um ângulo de 45 graus em relação ao disco de lixa.

É fundamental que o sentido de rotação dos discos de lixação seja afastado do ângulo agudo das pontas dos fios. Caso contrário, pode ocorrer a separação dos fios. Toque suavemente o feixe no disco de lixa de granulação média por um a dois segundos e, em seguida, toque o disco de lixa de granulação fina por mais um a dois segundos.

Repita isso mais três vezes, rotacionando axialmente o feixe 90 graus a cada vez. Ao finalizar, utilize um microscópio estereoscópico para verificar se a extremidade do feixe possui uma ponta afilada, com pequenas quantidades de isolamento removidas da extremidade de cada fio, e se não há desfiamento. Após reavaliar as impedâncias, tanto entre os fios individuais quanto entre cada fio e a placa de terra.

O tero colocando sua ponta em uma solução saturada de sulfato de cobre. Plaque o primeiro fio com uma corrente de 2,5 microampères. Usando um isolador de estímulo, injete a corrente durante um segundo. Pausa por um segundo e repita este processo três vezes.

Em seguida, plaque os três fios restantes da mesma maneira. Após isso, verifique novamente a impedância. Monte o adaptador na etapa de cabeçote de um sistema de gravação multicanal.

Prenda um alfinete para insetos curvado a um micromanipulador e fixe a extremidade do fio tero ao alfinete para insetos com cera dental após anestesiar e imobilizar uma barata conforme descrito no protocolo do texto. Use uma lâmina de barbear para cortar uma pequena janela entre o olho da célula O após remover a cutícula. Utilize pinças para remover os tecidos conjuntivos e gordura, expondo assim o cérebro. Em seguida, coloque solução salina para barata dentro da cápsula cefálica para cobrir o tecido cerebral e dessencapar o cérebro.

Use uma pinça fina para segurar suavemente a bainha localizada na parte superior do cérebro e utilize outra pinça fina para rasgar a bainha na área onde o fio está implantado. Em seguida, use um alfinete para insetos para abrir um pequeno orifício na cápsula cefálica anterior ao cérebro. Insira uma trança composta por 3 fios de cobre isolados com diâmetro de 56 mícon em um orifício.

Para servir como eletrodo de referência, posicione a ponta do tetro na superfície do cérebro com o micromanipulador e coloque-o próximo ao cérebro. Região de interesse. Coloque cuidadosamente dois pequenos pedaços de folha de acetato com dois por um milímetro de espessura, ligeiramente maiores que o orifício na cápsula craniana, anterior e posterior ao tede.

Abaixe lentamente o tetro em 150 a 250 micrômetros abaixo da superfície do cérebro, monitorando continuamente a qualidade da gravação. Procure por picos extracelulares espontâneos de tamanho moderado a grande, o que indica tanto uma área de interesse quanto a viabilidade geral do tecido neural. Quando estiver satisfeito com a localização do tetro, mova as duas peças da folha de acetato o mais próximo possível do tetro, sem tocá-lo.

É muito importante ter extrema cautela durante a dissecação e implantação para não romper os fios. Usando uma pequena espátula feita a partir da ponta achatada de uma agulha hipodérmica, aqueça a espátula com um bico de Bunsen. Em seguida, coloque a espátula na cera odontológica de modo que haja cera líquida na ponta da espátula.

Toque cuidadosamente a cera líquida em uma extremidade de uma folha de acetato que esteja mais distante do têro, permitindo que a cera líquida selo o espaço entre a folha de acetato e a cutícula da cabeça. Continue reaquecendo a espátula e depositando uma pequena quantidade de cera líquida sobre a folha de acetato. Aos poucos, mova-se em direção ao têro e, eventualmente, fixe o têro com uma pequena quantidade de cera dental.

Evite colocar cera quente na cavidade e no cérebro. Em seguida, fixe o eletrodo de referência com cera de maneira semelhante. Agora aqueça a cera que prende o tero ao micromanipulador para liberar o tero dele.

Em seguida, enrole o tero na cera da cabeça para fornecer alívio de tensão e cubra o laço de alívio de tensão com cera. Neste momento, remova cuidadosamente as restrições e transfira a preparação para uma placa de Petri, que está sobre gelo. Imobilize a preparação com o lado dorsal voltado para cima usando pinos grandes em forma de sela. Com uma pistola de cola, fixe um palito de madeira de modo que ele se estenda do pro nóio até o abdômen.

Em seguida, fixe a ponta do tubo tero na extremidade posterior da haste com cera dental. Em seguida, fixe o tero e o eletrodo de referência na extremidade anterior da haste com cera dental. Então, puxe o tero a partir da extremidade do soquete do tubo o máximo possível, mas não o force.

Fixe-o ao adaptador com cera para eliminar a possibilidade de o animal danificar a parte exposta do tero. Após remover todas as restrições, fixe o eletrodo de referência ao tubo do tero com cera dental. Estabeleça gravações neurais e de vídeo de boa qualidade, conforme descrito no protocolo textual, antes de iniciar os experimentos comportamentais; para experimentos de locomoção, permita que a barata explore uma arena de plexiglás; para experimentos de escalada.

Utilize uma arena longa e estreita com um obstáculo em formato de prateleira para o animal subir por cima ou passar por baixo, ou então um bloco de plexiglass para o animal escalar. Durante a gravação, gere um pulso TTL a partir do computador usando um comando MATLAB personalizado. O pulso TTL gera uma marca temporal para o sistema de gravação e acende ou apaga a luz LED para os ensaios de estimulação.

Trens de pulsos de corrente entre os fios de gravação podem ser usados para evocar comportamento após a conclusão do experimento, passados cinco segundos de corrente contínua de cinco microampères, por meio de uma das pontas do fio e do eletrodo de referência, para depositar cobre no cérebro. Para marcar a localização da ponta do fio, são apresentados aqui traços brutos de tensão de eletrodos individuais dentro de um feixe de tero. Observe a diferença nos traços de tensão entre os diferentes eletrodos.

Três unidades foram classificadas usando MLUs. Uma visão tridimensional da energia da forma de onda, conforme registrada em três dos quatro eletrodos, é apresentada aqui. Cada um é um evento de limiar único, codificado por cores de acordo com o agrupamento ao qual foi finalmente atribuído.

Este instantâneo foi retirado de um vídeo de um ensaio de escalada; acima de cada quadro, são mostradas a velocidade normalizada, a altura da barata e a taxa instantânea de disparo de duas unidades classificadas, desde o primeiro quadro até o quadro atual. O tempo zero indica o início da escalada; a taxa de disparo foi normalizada de zero a um, e a velocidade e altura foram normalizadas de zero a 0,5 para fins de exibição. As marcas abaixo de cada quadro indicam os picos das duas unidades classificadas dentro de um segundo do quadro atual. A linha laranja indica o intervalo de tempo coberto por cada quadro, e o retângulo azul indica o dobro da largura do kernel utilizado para calcular a taxa instantânea de disparo para o quadro atual.

Este registro foi feito no corpo em forma de leque direito. A taxa de descarga da unidade um um aumentou durante a escalada, e o aumento da taxa de descarga precedeu o aumento da velocidade. A unidade um dois permaneceu silenciosa antes da escalada, mas começou a disparar após o início da escalada.

Nesta imagem do Ensaio de Exploração da Arena, a linha oval vermelha indica a forma da barata naquele quadro e a linha tracejada vermelha indica a posição do centro de massa da barata nos 10 quadros anteriores. Aqui são mostradas a velocidade de curva e de locomoção para frente, bem como a taxa de disparo instantânea da unidade dois um. Os potenciais de ação da unidade dois, um dentro de quatro segundos do quadro atual são mostrados abaixo do quadro.

Como antes, a linha laranja indica o tempo coberto por cada quadro e o retângulo azul indica duas vezes a largura do kernel utilizado para calcular a taxa instantânea de disparos para o quadro atual. Esta gravação foi realizada na região mediana do corpo do leque. A posição da barata e sua orientação corporal em cada quadro foram extraídas usando software de rastreamento conforme descrito no protocolo textual e utilizadas para calcular a velocidade de avanço e de direção, bem como a taxa instantânea de disparos.

A taxa de disparo da unidade dois um aumentou quando a barata começou a andar e foi correlacionada com a velocidade de locomoção. Para muitas unidades do complexo central, o aumento na taxa de disparo foi restrito a estados específicos de locomoção. Por exemplo, a unidade dois um foi ajustada à locomoção para frente, independentemente da velocidade de curva.

A trajetória da barata no vídeo é mostrada aqui. O ponto preto grande indica o ponto inicial da barata, e cada ponto preto pequeno indica a posição da barata em cada quadro. A trajetória foi codificada por cores para mostrar a taxa instantânea de disparo da unidade dois, variando de azul para indicar uma taxa baixa a vermelho para indicar uma taxa alta.

Neste mapa de taxa de disparo da Unidade dois um, o eixo X representa a velocidade de rotação, e o eixo Y representa a velocidade de locomoção para frente. Velocidades de rotação positivas indicam rotação para a direita e velocidades de rotação negativas indicam rotação para a esquerda. A colocação do eletrodo é determinada pelos depósitos de cobre visíveis após o procedimento histológico conforme descrito no texto.

Alternativamente, o eletrodo pode ser revestido com um corante fluorescente e localizado por microscopia confocal. Este é um conjunto complexo de técnicas que, mesmo quando dominado, exige um tempo total de muitas horas; é preferível dividir os elementos em subconjuntos, fabricar e testar vários teros antes de iniciar um experimento de implante.

É importante lembrar de pré-testar um tero para verificar a impedância adequada entre fios e individual, além de tomar extremo cuidado durante a implantação e a definição de limiares no cérebro. Métodos como o rastreamento automatizado em tempo real podem ser incorporados para simplificar o procedimento de análise. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar e implantar teros para coordenar a atividade fisiológica com os comportamentos complexos de um inseto em movimento livre.