Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

O objetivo geral do experimento a seguir é imobilizar as estruturas celulares das células vegetais por alta pressão, congelamento e substituição por congelamento rápido para visualização subsequente por microscopia eletrônica de transmissão. Isso é conseguido preparando cuidadosamente uma amostra de tecido para congelamento, codificando-a com um crioprotetor para garantir que o tecido seja minimamente danificado durante o congelamento de alta pressão. Como segunda etapa, a amostra é rapidamente congelada sob alta pressão, o que imobiliza os componentes celulares e limita a formação de gelo cristalino, resultando em células com morfologia intacta.

Em seguida, a substituição rápida e livre é realizada para substituir a água celular por solventes orgânicos e introduzir fixadores como o tetróxido de ósmio, ligando e estabilizando as ultraestruturas celulares. São obtidos resultados que mostram que o congelamento de alta pressão e a substituição rápida por congelamento preservam efetivamente as estruturas celulares e a morfologia da planta com base na microscopia eletrônica de transmissão. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a fixação química convencional, é que o HPF imobiliza o conteúdo celular em milissegundos, minimizando a formação de artefatos.

Geralmente, o protocolo QFS é desafiador para um iniciante, por isso é recomendável que duas pessoas trabalhem juntas até que os usuários se sintam confortáveis com o procedimento. Equipamento de proteção individual, incluindo luvas criogênicas e óculos de proteção, deve sempre ser usado ao manusear nitrogênio líquido Encha uma caixa isolada contendo suportes de frascos criogênicos com nitrogênio líquido para que os suportes fiquem completamente cobertos. O uso do fixador durante a substituição por congelamento rápido ou QFS é 1% de ósmio, tetróxido e 0,1% de acetato de mictório em acetona.

Depois de preparar um grande volume da solução seguindo todos os avisos de segurança, alíquotas de 1,5 mililitros são dispensadas em frascos criogênicos e armazenadas congeladas em nitrogênio líquido. Coloque o número apropriado de frascos criogênicos rotulados contendo substituição por congelamento ou meio FS no alumínio, dois suportes no nitrogênio líquido. Com este protocolo, até quatro discos, cada um contendo uma única amostra, podem ser colocados em um único frasco cerca de uma a uma hora e meia antes da preparação da amostra.

O congelador de alta pressão deve ser ligado e preparado para o funcionamento. Este protocolo também requer pasta de levedura como crioprotetor extracelular para preencher o espaço ao redor da amostra. No transportador de amostras, misture um pouco de fermento de padeiro com um volume aproximadamente igual de 10% de metanol usando um palito até que a pasta fique lisa.

Com uma consistência de mistura para panquecas, a quantidade de pasta necessária depende do número de amostras para 10 amostras ou menos, a pasta pode ser misturada em um tubo de microcentrífuga. Para preparar uma amostra para congelamento de alta pressão ou HPF, remova uma folha de interesse da planta e coloque-a suavemente em um pedaço de cera dental ou outra superfície de corte. Use um punção de 0,2 milímetro para cortar uma amostra da folha.

A parte mais crítica deste procedimento é esta preparação de amostra para carregamento neste transportador de amostras. Se a amostra for mal manuseada, nenhuma outra etapa resgatará o custo do dano Trabalhando sob um microscópio de dissecação. Encontre o lado de 0,2 milímetro do transportador de amostras tipo A e cubra-o com pasta de fermento.

Coloque o disco de folhas no suporte de amostras, alise a pasta com um pincel fino para garantir que o disco esteja completamente cheio e a pasta esteja nivelada com a borda do suporte. Coloque o transportador de amostras no suporte de amostras, que deve estar seco e à temperatura ambiente, cubra a amostra com uma superfície plana de suporte de amostras tipo B para baixo. Coloque a caixa isolada que foi preparada anteriormente em cima da máquina.

Leve a amostra no suporte de amostra para o freezer de alta pressão. Insira o suporte de amostra contendo a amostra no freezer de alta pressão. Inicie um ciclo de congelamento pressionando o botão automático do jato, que deve ser concluído em um ou dois segundos, trabalhando o mais rápido possível.

Remova o suporte da amostra da máquina e coloque a ponta. Guarde a amostra no nitrogênio líquido na caixa isolada. Mergulhe as pontas de dois pares de pinças no nitrogênio líquido para resfriá-las após o congelamento.

Os transportadores só devem ser manuseados com pinças resfriadas com nitrogênio líquido trabalhando sob o nitrogênio líquido. Abra o suporte da amostra girando-o no sentido anti-horário e remova o suporte da amostra do suporte com uma pinça resfriada por nitrogênio líquido, garantindo que o disco esteja sempre no nitrogênio líquido ou vapor. Abra um frasco criogênico contendo mídia FS e coloque a tampa na lateral da caixa.

Segure o frasco criogênico com uma pinça pré-resfriada e use a outra pinça para colocar o disco no frasco criogênico. Volte a enroscar a tampa do frasco criogênico, tomando cuidado para não prender nitrogênio líquido no frasco. O nitrogênio líquido se expande 700 vezes durante o aquecimento e qualquer nitrogênio líquido preso pode causar explosões durante esse período.

Repita esse processo até que todas as amostras desejadas sejam congeladas. Vários discos de folhas contendo o mesmo tipo de amostra podem ser colocados no mesmo frasco. Para iniciar os preparativos para substituição livre, mergulhe completamente um bloco aquecedor de alumínio em nitrogênio líquido por 10 minutos ou até que a ebulição nucleada pare.

Enquanto isso, coloque uma camada de gelo seco no fundo do recipiente para ser usado como uma câmara QFS. Um recipiente de isopor ou balde de gelo com gelo seco picado ou pellets pode ser usado. Uma sonda de temperatura é necessária para este procedimento.

Um termopar é colocado na parte superior de um frasco criogênico para que ele atinja o fundo do tubo e a tampa do tubo é selada com resina para que nenhum líquido vaze. Encha o tubo com 1,5 mililitros de acetona no início de cada corrida QFS. Certifique-se de que as tampas dos frascos estejam bem aparafusadas para que a mídia FS não vaze durante o fs.

Insira rapidamente os frascos criogênicos contendo o samples junto com a sonda de temperatura nas fileiras intermediárias do bloco aquecedor. Comece a registrar a temperatura usando luvas criogênicas isoladas ou pinças grandes. Despeje todo o nitrogênio líquido do bloco aquecedor.

Tome cuidado para não derramar os frascos criogênicos. Coloque o bloco contendo os frascos para injetáveis na camada de gelo seco na câmara QFC. Certifique-se de que o bloco seja colocado de forma que os tubos fiquem na horizontal, mas com uma ligeira inclinação para cima.

Não deve haver vazamento se os frascos criogênicos corretos forem usados. Encha a câmara QFS com gelo seco para que os tubos FS fiquem cobertos. Embora não seja necessário cobrir a parte superior do bloco, coloque a tampa na câmara.

O QFS deve ser realizado em uma capela de exaustão. Colocou uma câmara QFS com as amostras em um agitador rotativo de plataforma e girou a 125 RPM por 120 minutos. Durante esse período, a temperatura do bloco deve aumentar gradualmente para cerca de 80 graus Celsius negativos.

A agitação garante a mistura dos componentes para melhor fs. Após duas horas, remova o gelo seco da câmara. Use uma luva criogênica para levantar rapidamente o bloco aquecedor da câmara QFS e despeje rapidamente o gelo seco em um recipiente secundário.

Continue agitando por mais uma hora. Durante esse período, a temperatura deve aumentar para cerca de 15 graus Celsius negativos a 20 graus Celsius negativos. No final da hora, remova as amostras e a sonda de temperatura da câmara QFS e coloque-as no agitador em temperatura ambiente por mais 10 a 15 minutos até atingirem a temperatura ambiente.

Pare de registrar a temperatura quando a substituição rápida e livre for feita. Remova cuidadosamente a mídia FS de cada frasco criogênico com uma pipeta de transferência de plástico e coloque no recipiente apropriado para resíduos tóxicos. Lave as amostras quatro vezes com acetona a 100%.

Recolha as duas primeiras lavagens e coloque no recipiente de lixo tóxico. Tome cuidado para não descartar as amostras ao remover a acetona. Após a lavagem das amostras, use uma pinça fina para remover as amostras de tecido do transportador de amostras.

Mantenha as amostras molhadas com acetona enquanto isso é feito e trabalhe com muito cuidado para evitar quebrá-las. Não é incomum que a pasta de levedura caia das amostras. Neste ponto, a pasta de fermento é geralmente um marrom muito escuro, enquanto o tecido da folha ainda é verde.

Freqüentemente, as amostras de tecido caem do transportador de amostras durante a coleta de amostras FS usando uma pipeta de transferência em frascos criogênicos contendo acetona. Posteriormente, as amostras são preparadas para microscopia eletrônica de transmissão de acordo com protocolos padrão. A.Uma curva típica para mudanças de temperatura durante o QFS é mostrada neste gráfico.

A temperatura aumenta rapidamente de 196 graus Celsius negativos, a temperatura do nitrogênio líquido para cerca de 80 graus Celsius negativos. O pico no início da corrida é devido à eletrônica da sonda e não reflete a medição de temperatura real depois que as amostras HPF e QFS são preparadas para visualização por microscopia eletrônica de transmissão. Resultados típicos são mostrados nessas imagens a partir de amostras de folhas de opsis de coelho.

As membranas plasmáticas lisas e pressionadas contra a parede celular indicam boa fixação. Um dema de plasma ramificado é visível em alta ampliação. Outras organelas também são claramente visíveis.

Eles incluem cloroplastos e as mitocôndrias dos tilacóides, microtúbulos GOGI e plasmas desa, os grandes VAEs centrais permanecem intactos. O manuseio inadequado durante H-P-F-Q-F-S resulta em artefatos, incluindo danos induzidos por cristais de gelo e lise. O precipitado de chumbo também pode se formar durante a coloração das seções Uma vez dominado.

Esta técnica pode ser feita em quatro horas e meia se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido e tetróxido de ósmio pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar na hotte e usar equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, jalecos e óculos de proteção, devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.