Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

O objetivo geral deste procedimento é coletar corações por dissecção manual rápida de embriões vivos de peixe-zebra para obter Mr.NA.Isso é realizado pela primeira pipetagem, muitos embriões anestesiados para cima e para baixo através de uma ponta de pipeta estreita para liberar simultaneamente os corações dos corpos embrionários. Em seguida, os corações dissecados são separados dos detritos embrionários em duas etapas de filtração rápida. Em seguida, os corações marcados com fluorescência são separados manualmente dos detritos restantes.

Finalmente, o RNA específico cardíaco é extraído dos corações coletados. Em última análise, o protocolo de dissecção do coração é usado para coletar quantidades suficientes de corações embrionários para realizar a análise do transcriptoma. Este método ajudará a fazer perguntas-chave no campo de desenvolvimento do coração de traças, como quais transcritos são expressos dentro do coração em diferentes estágios de desenvolvimento, e também comparar expressões cardíacas selvagens e mutantes Para obter embriões de peixe-zebra para extração cardíaca, cruze peixes transgênicos adultos expressando uma proteína fluorescente no coração, como EGFP transgênico de milha sete sob o microscópio estereoscópico.

Monitore o desenvolvimento dos embriões. Verifique se os corações estão realmente marcados com fluorescência e retire manualmente os embriões quando os embriões atingirem o estágio desejado. Transfira cerca de 100 embriões para um tubo de fuga de 1,5 mililitro e adicione o ponto 16 miligramas por mililitro de trica em meio E três para anestesiá-los.

Coloque o tubo no gelo. Remova a solução trica e use um mililitro de meio L 15 10% FBS gelado para lavar os embriões, mantendo-os no gelo. Depois de remover esta lavagem, adicione um mililitro de L 15 FBS e use uma ponta redonda de carregamento de gel para pipetar os embriões para cima e para baixo cinco a oito vezes para romper completamente as gemas, pipetar os embriões gota a gota na superfície da solução para que a gota estoure e os embriões sejam suavemente interrompidos.

Para este primeiro lote de embriões dissecados sob um microscópio estereoscópico, avalie sua integridade e a proporção de corações dissecados e ajuste a maneira de pipetar de acordo. Para lotes subsequentes, coloque um filtro de 100 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e aplique a amostra embrionária. Em seguida, use um mililitro de L 15 FBS para rin o tubo de fuga e aplique a solução no filtro para lavar os corações que permaneceram no filtro.

Use L 15 FBS para lavá-lo duas vezes. Em seguida, coloque um filtro de 30 micrômetros em um tubo de centrifugação de 15 mililitros e aplique o fluxo contendo os corações. Use L 15 FBS para enxaguar este filtro, que retém os corações e lava os detritos menores.

Em seguida, vire o filtro de 30 micrômetros de cabeça para baixo sobre uma placa de Petri revestida com agros e aplique três lavagens de um mililitro de meio L 15 FBS para lavar os corações para fora do filtro Sob um microscópio fluorescente, use uma pinça para separar manualmente os corações positivos para GFP dos tecidos não fluorescentes, concentrando-os no centro da placa. A fisiologia dos corações parece normal, pois eles ainda estão batendo após a dissecção. Procedimento. Para isolar o mRNA dos corações, colete-os no menor volume possível de meio e pipete-os em um tubo de 1,5 mililitro no gelo contendo 0,75 mililitros de RNA.

Mais tarde, sob o microscópio fluorescente. View a ponta da pipeta para verificar se nenhum coração permanece preso à ponta da pipeta. Depois de puxar os corações de várias rodadas de isolamento para o tubo de RNA mais tarde, de acordo com o protocolo de texto, centrifugar as amostras a 15.700 Gs e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, sob um microscópio fluorescente, colete cuidadosamente o máximo de sato possível e transfira para uma placa de Petri revestida com 1% de agros contendo três mililitros de meio L 15 10% FBS. Em seguida, sob uma capa química, adicione 0,5 mililitros de triol ao tubo que contém os corações sedimentados e mantenha no gelo Sob o microscópio fluorescente, transfira os corações que permaneceram no sobrenadante para um prato fresco revestido com 1% de agros com L 15 10% FBS para diluir o RNA posteriormente, que é muito viscoso. Em seguida, colete os corações em um pequeno volume e transfira-os para o tubo de corações sedimentados em triol para romper os corações, vórtice o tubo e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, sob uma capa química, adicione 100 microlitros de mistura de clorofórmio e transfira a solução para um tubo de 1,5 mililitro PrepU, PLG Incube por três minutos em temperatura ambiente, centrifugue uma amostra a 15.700 Gs e quatro graus Celsius por 15 minutos e transfira a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione cinco a 10 microgramas de glicogênio e 250 microlitros de isopropanol pré-resfriado. Misture bem e incube durante a noite a menos 20 graus Celsius no dia seguinte.

Centrifugue as amostras a 15.700 Gs e quatro graus Celsius por 30 minutos e descarte o snat. Aplique um mililitro de etanol 75% para lavar a centrífuga da paleta e descarte o snat. Deixar evaporar o etanol restante do sedimento à temperatura ambiente até que este fique branco.

Adicione 20 microlitros de água destilada dupla livre de RNAs ao pellet e incube a 55 graus por 10 a 15 minutos para dissolver o RNA. Em seguida, coloque os tubos no gelo. Use um espectrofotômetro para determinar a concentração e pureza do RNA e execute uma amostra em um gel 1% agros para avaliar a integridade do RNAA A comparação das amostras de coração antes da classificação dos detritos embrionários 56 horas após a fertilização versus 36 horas após a fertilização é mostrada aqui.

Embriões 56 horas após a fertilização produziram mais detritos embrionários do que 36 horas após a fertilização após a filtração para determinar a pureza da amostra de coração 56 HPF, os níveis de expressão de transcritos cardíacos versus extracardíacos foram comparados por RTQPCR. Este gel mostra RNA extraído dos corações isolados e dos embriões desfeitos sem coração. As medições de absorbância revelaram que 300 corações produziram cerca de 660 nanogramas de RNA.

Isso é 33 nanogramas por microlitro em um volume final de 20 microlitros. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados por experimentos R-T-Q-P-C-R para os marcadores mostrados aqui. Como esperado, a milha sete foi altamente enriquecida na amostra de coração em comparação com o embrião sem amostra de coração, como visto aqui.

O marcador de células endoteliais, KDRL, foi moderadamente enriquecido no coração. O marcador eritrocitário hemoglobina beta embrionária 1,1 foi super-representado na amostra de coração, embora os corações ainda estivessem batendo após a dissecção, o que deveria expelir os glóbulos vermelhos do coração. Nos níveis de contraste do marcador de lente alfa A cristalino e do marcador do SNC, a GFAP foi consideravelmente reduzida na amostra de coração.

Esses resultados mostram que o protocolo de dissecção cardíaca produz RNA cardíaco específico de alta qualidade de embriões inteiros de peixe-zebra. Para este experimento, é importante monitorar a amostra para evitar a perda de corações durante o procedimento de dissecção.