Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

O objetivo geral desta técnica é reunir propriedades biológicas relevantes de células isoladas, visualizando as forças de suas interações características de substrato celular usando microscopia de luz padrão. O método apresentado é uma tecnologia de plataforma para mecanobiologia. Pode ajudar a investigar questões-chave na pesquisa do câncer, como o papel da contração celular na metástase das células cancerígenas.

As principais vantagens da técnica são que ela extrai informações neurobiológicas de forma robusta com pouco treinamento do usuário. É compatível com a microscopia de luz padrão e é voltado para alto rendimento. Em terceiro lugar, este método fornece informações sobre as propriedades biológicas mecânicas das células de câncer ósseo humano.

Também pode ser aplicado a tipos de células automáticas, como células musco lisas ou cardiomiócitos. Comece colocando o substrato de vidro de forma que a micro matriz de postes fique voltada para cima no poço de uma placa de 12 poços, adicione indiretamente um mililitro de etanol a 99% ao poço para que o substrato seja coberto. Certifique-se de que não haja formação de bolhas durante as etapas de manuseio de líquidos e que a micro matriz de postes esteja sempre coberta por uma fina camada de líquido.

Em seguida, incube a matriz em temperatura ambiente por 20 a 30 segundos antes de adicionar um mililitro de água deionizada estéril na lateral do poço. Depois de se misturar com o etanol, aspire aproximadamente um mililitro da solução de etanol do poço e adicione mais um mililitro de água deionizada. Repita esse processo pelo menos três vezes para molhar a amostra.

Em seguida, substitua a água deionizada no poço por PBS da mesma maneira, adicionando e aspirando aproximadamente um mililitro de cada vez por três repetições. Em seguida, use esse mesmo processo para substituir o PBS por médio. Agora que a matriz está coberta com aproximadamente um mililitro de meio pipeta 25.000 células de interesse em um mililitro de meio no poço com uma micro matriz de pós preparada.

Em seguida, feche a placa de vários poços e transfira-a para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Deixe as células aderirem e crescerem em cima de micro pinos por seis a sete horas, inspecionando o processo de adesão. Ocasionalmente, usando um microscópio de luz, aspire o meio do poço e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS.

Certifique-se de aplicar força suave durante a lavagem com PBS para remover os detritos celulares acumulados na micro matriz de postes durante a incubação e para separar as células mortas. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de uma solução de formaldeído tamponado a 3,7% por cinco minutos para fixar as células. Em seguida, remova a solução de formaldeído e lave o micro post array duas vezes usando um mililitro de água deionizada estéril.

Para cada lavagem, cubra as células fixas com corante azul brilhante 0,05% kumasi em 50% de água, 40% de etanol e 10% de ácido acético por cerca de 90 segundos, lave o excesso de solução de coloração com dois enxágues em um mililitro de água deionizada estéril. Em seguida, adicione um mililitro de água deionizada ao micro post array e verifique o resultado da coloração sob um microscópio de luz. Comece adicionando dois mililitros de água deionizada a uma placa de Petri com fundo de vidro fino usando uma pinça, transfira a micro matriz de postes da placa de 12 poços para a placa de imagem com um micro poste voltado para cima.

Em seguida, coloque a placa de Petri de imagem no estágio móvel de um microscópio óptico. Se a óptica do microscópio não for corrigida infinitamente, gire o anel de compensação da lente usada para a imagem até que o número na escala represente a espessura total de todos os materiais ao longo do caminho óptico. Em seguida, remova todos os anéis de contraste de rosto do caminho óptico para ativar o modo de campo claro comum e, em seguida, reduza a íris no lado da iluminação para 50% Alinhe a placa de Petri para que os micro postes da matriz formem uma linha horizontal ou vertical no campo de observação.

Defina um ponto inicial no canto superior esquerdo e mova a placa de Petri passo a passo pelo palco. Digitalizando a micro matriz de postes enquanto tira várias imagens de alta resolução com uma objetiva de 20 x ou 40 x. Procure ter uma única célula no centro de cada imagem em cada nova posição.

Varra ao longo dos ZXs da parte inferior do micro poste em direção à ponta do micro poste até que a ponta esteja em foco. Usando a roda de ajuste fino do microscópio. Em seguida, abaixe o plano de foco em dois a três mícrons em direção à parte inferior do micro poste.

Comece carregando o software mec, profiler, e carregando uma variedade de imagens que precisam ser analisadas clicando em abrir e selecionando as imagens. Em seguida, vá para a seção de configuração e insira os parâmetros conforme as instruções do manual do software. Em seguida, analise as imagens uma a uma.

Comece selecionando o botão de corte e clique e arraste para formar um contorno retangular ao redor da área de interesse. Quando terminar, clique duas vezes dentro do retângulo desenhado para finalizar a ação. Em seguida, selecione desenhar contorno da célula e use o cursor de mira para desenhar um contorno ao redor de todos os micro postes cobertos pela célula visível na imagem.

Descarte quaisquer micro postagens indesejadas clicando para descartar postagens e use o cursor de mira para desenhar. Em seguida, coloque todas as micro postagens que pertencem a uma célula fora da seção de imagem ou que são desviadas por qualquer outro motivo, mas não pela célula de interesse. Em seguida, clique em Localizar OIDs para iniciar a sub-rotina do software.

Ajuste a configuração do filtro ao lado do botão encontrar OIDs até que todas as micro postagens sejam registradas, o que é visível por uma Cruz Vermelha em seu centro. Se houver várias ou faltas posições de micro postagem, use a função de edição manual clicando em edição manual e use a mira do mouse para selecionar a micro postagem em questão. Clique duas vezes dentro do retângulo e coloque um único marcador vermelho na seção de imagem ampliada, que fecha automaticamente.

Encontre a micro grade de postagem ideal ativando a função de geração de grade com um clique do mouse. Certifique-se de que a posição corresponda à verdadeira cabeça do micro poste mostrada por um anel azul dentro da linha de contorno da célula desenhada. Em seguida, corrija quaisquer marcadores de grade mal colocados dentro da área da célula, quando necessário.

Usando a função de edição manual correspondente com um clique do mouse, use a mira para selecionar a pergunta de micro postagem clicando e arrastando-a. Clique duas vezes dentro do retângulo que aparece e coloque o marcador azul corrigido na seção de imagem ampliada, que fecha automaticamente. Em seguida, clique em calcular deflexões para obter um histograma dos valores de deflexão calculados com base na diferença entre uma posição de micro postagem dentro da seção da imagem e a grade ideal gerada.

Por fim, salve a análise completa, incluindo as tabelas de valores. Continue a análise da imagem clicando em redefinir view para analisar outra seção da imagem ou clique na próxima exibição de imagem. Mostrado. Aqui está um exemplo de perfil meno de duas linhas de células de câncer ósseo Q oh nove células, que têm baixo potencial metastático, e as células M 132 altamente metastáticas foram assentadas em um aumento do mesmo lote de produção.

O resultado mostra que as células Q oh nove tendem a aplicar mais força em seus pontos de fixação do que as células altamente metastáticas, categorizando os valores de força. Com relação à área celular, verifica-se que a força média por célula é elevada para huo nove células em comparação com M 132. Além disso, a força média por micro poste aumenta à medida que as células se espalham até que a força média por pino atinja um valor mais estável.

Além das diferenças nas variâncias morfológicas, podem ser quantificadas com resultados interessantes. Por exemplo, em contraste com as células M 132 altamente metastáticas, que tendem a ocupar menos micro postes, as células HU oh nove apresentam um perfil mais heterogêneo em termos de cobertura de micro postes. Em suma, o perfil Meno para a linha celular parental HU oh nine revela que eles normalmente cobrem mais área e aplicam um pouco mais de força aos micropostes.

Considerando que a linha celular metastática M 132 e o tipo de célula agressiva caracteristicamente cobrem menos micro pinos e aplicam menos força por micro poste. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de canalizá-lo com muito cuidado e nunca diretamente para a micro matriz de postagem. Evitando introduzir bolhas, pois elas levam ao colapso dos micropostes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair informações biológicas meno de células individuais isoladas usando micro pós-Aries em combinação com nosso perfil de malha ou software. Aproveite seus resultados.