Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Bu titrasyon ELISA'nın genel amacı, yeni bir algoritma kullanarak iki bağlayıcı ortağın afinite sabitini tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem, yalnızca protein ligandı etkileşimi ve reseptör araştırması alanında değil, aynı zamanda farmasötik araştırma ve farmakoloji gibi uygulamalı yaşam bilimlerinde de temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir reseptör ligand etkileşiminin afinite sabitinin, bir reseptörün bir ELISA plakası üzerinde bir ligand ile titre edilmesi ve yeni bir değerlendirme algoritması kullanılarak kolayca belirlenebilmesidir.

Bu prosedüre, Integrin Alpha 2 A Domain'in stok çözeltisini TBS magnezyum klorür tamponunda mililitre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyrelterek başlayın. Bu gösteride hem vahşi bir tür hem de mutant bir Integrin Alpha 2 A Domain kullanılacaktır. Yarım alanlı bir mikrotitre plakası üzerindeki bir sıranın her bir kuyusunu 50 mikrolitre Integrin Alpha 2 A Domain kaplama solüsyonu ile doldurun.

Her titrasyon satırını en azından çift öğeler halinde gerçekleştirin. Bu örnekte, her titrasyon satırı dörtlü olarak gerçekleştirilir. Plakayı folyo ile kapatın ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede bırakın.

Ertesi gün, kaplama solüsyonunu çıkarın ve her bir kuyucuğu 15 mikrolitre TBS magnezyum klorür tamponu ile doldurun. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve kuyucukları yeni yıkama solüsyonu ile doldurun. Yıkamalar, fiziksel absorpsiyon ile plastik yüzeye hareketsiz hale getirilmemiş çözünür reseptör moleküllerini uzaklaştıracaktır.

Bir sonraki adım, her bir oyuğa TBS magnezyum klorür tamponunda 50 mikrolitre yüzde bir BSA çözeltisi ekleyerek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmektir. Plakayı tekrar kapatın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Mikrotitre plakasının kuyucukları BSA ile bloke edilirken, ligand Rhodocetin'in seri bir seyreltmesini hazırlayın.

Bu durumda 243 emaye aşınmış Rhodocetin başlangıç konsantrasyonu ve 2.3'lük bir seyreltme faktörü kullanılır. Bu deneydeki sekiz titrasyon eğrisi için, bir numaralı test tüpünde TBS magnezyum klorür içinde yüzde bir BSA'da en yüksek konsantrasyonda 920 mikrolitre Rhodocetin çözeltisi hazırlayın. TBS magnezyum klorür içinde yüzde bir BSA çözeltisinin 520 mikrolitresini iki ila on bir etiketli diğer on test tüpünün her birine pipetleyin.

400 mikrolitre Rhodocetin solüsyonunu test tüpünden ikinci test tüpüne aktarın. Her iki çözeltiyi de şutla karıştırın ve ardından bu karışımdan 400 mikrolitreyi üçüncü test tüpüne aktarın. Test tüpü on bir olana kadar bu seri seyreltmeye devam edin.

Bu prosedürün başarısı için, kuyucukların kurumamasını sağlamak için her kuyuyu her zaman hızlı bir şekilde çözelti ile doldurmak önemlidir. Bir saatlik inkübasyonun tamamlanmasının ardından, bloke edici çözeltiyi mikrotitre plaka kuyucuklarından çıkarın. Hemen 50 mikrolitre Rhodocetin solüsyonunu test tüpü bir'den birinci sütunun kuyularına, çözeltiyi test tüpü iki'den kolon iki'nin kuyucuklarına ekleyin ve on birinci kolondan devam edin.

On iki sütunun kuyucuklarına ligand içermeyen bir kontrol olarak 50 mikrolitre yüzde bir BSA ve TBS magnezyum klorür ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve oda sıcaklığında bir buçuk saat inkübe edin. Bağlı olmayan ligand moleküllerini çıkarmak için, bağlayıcı çözeltiyi çıkarın ve her bir kuyucuğu 50 mikrolitre HBS magnezyum klorür tamponu ile doldurun.

Ardından HBS arabelleğini çıkarın ve yeni HBS arabelleği ekleyin. Reseptörü ve bağlı ligandı kimyasal olarak sabitlemek için, mikrotitre plakasının her bir kuyusunu HBS magnezyum klorür tamponunda 50 mikrolitre yüzde 2.5'lik bir glutaraldehit çözeltisi ile doldurun. Mikrotitre plakasını oda sıcaklığında on dakika inkübe edin.

Fiksasyon solüsyonunu çıkararak ve her bir kuyucuğu 50 mikrolitre TBS magnezyum klorür tamponu ile doldurarak fazla glutaraldehiti çıkarın ve etkisiz hale getirin. Yıkama tamponunu çıkarın ve her kuyucuğa yeni yıkama tamponu ekleyin. Bu tahlillere başlamak için, yıkama tamponunu mikrotitre plakasının tüm oyuklarından çıkarın ve her bir oyuğa 50 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin, yüzde bir ila iki bin BSA TBS magnezyum klorür içinde seyreltin.

Plakayı tekrar kapatın ve oda sıcaklığında inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini tüm kuyucuklardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 50 mikrolitre TBS magnezyum klorür tamponu ekleyin. TBS magnezyum klorür tamponu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, her bir kuyucuğa, TBS magnezyum klorür içinde yüzde bir BSA içinde bir ila iki bin seyreltilmiş 50 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve oda sıcaklığında bekletin. İkincil antikor çözeltisini kuyucuklardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 50 mikrolitre TBS magnezyum klorür tamponu ekleyin.

Üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, tüm sıvı kalıntılarını gidermek için mikrotitre plakasını bir doku bezine hafifçe vurun. Çok kanallı bir pipet kullanarak, enzimatik dönüşümü mümkün olduğunca aynı anda başlatmak için mikrotitre plakasının her bir oyuğuna derhal 50 mikrolitre alkalin fosfataz tespit solüsyonu ekleyin.

Plakayı, en yüksek ligand konsantrasyonuna sahip oyuklardaki çözelti sararıncaya kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Sinyal yoğunluğuna bağlı olarak, inkübasyon süresi beş dakika ile bir saat arasında değişebilir. Fosfataz substratının dönüşümünü, alkalin fosfataz tespit çözeltisinin aynı sırayla her bir oyuğa 50 mikrolitre 1.5 molar sodyum hidroksit çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanarak durdurun.

Her iki çözeltinin de iz bırakmadan karışmasını sağlamak için plakayı birkaç dakika bırakın. Bir ELISA okuyucu kullanarak her kuyucuğun 405 nanometresindeki optik yoğunluğu ölçün. Ham veri tablosunu açarak veri analizini başlatın.

Excel dosyasından sütunları kopyalayın, Graph Pad Prism Five'ı açın, Ana Menü'de yeni bir proje dosyası açın ve yeni veri ve grafik altında X Y biçimini seçin. Seçeneği seçin Keşfet ve Y ekseni için her değer için Tek Bir Nokta Çiz ve bunları sırasıyla X ve y değerleri olarak Grafik Pedi Prizma'nın veri sayfasına yapıştırın. 405 nanometre değerlerindeki optik yoğunluğu bir sütun formatına aktarın.

Veri sayfasında, ilk sütun eklenen ligand olarak konsantrasyonları X değerleri olarak temsil ederken, sağdaki sütunlar Y değerleri olarak sekiz titrasyon eğrisinin sinyal değerlerini içerir. Yarı logaritmik bir çizim yapılacağı için, ligandsız kontrollerin sinyallerini sayan son satır, konsantrasyon sıfır, silinir. Grafik Pedi Prizması, grafik bölümünde görülen grafiği çizer.

X ekseni için yarı logaritmik bir ölçekleme seçilir. X ekseni, 405 nanometrede OD değerleri olarak ölçülen sinyal değerlerini gösterir. Sembollerden herhangi birine çift tıklayarak, basit şekil ve renkle seçilebilir ve işaretlenebilirler.

Yabani tip form için titrasyon değerleri, farklı kırmızı gölgelendirmelerde dairelerle vurgulanırken, mutant form için titrasyon sinyalleri mavi karelerle işaretlenir. Analiz alt programını açın ve X Y Analizi altında, Doğrusal Olmayan Regresyon seçeneğini belirleyin ve yeni bir denklem oluşturmak için Yeni düğmesine basın. Titrasyon eğrisi denklemini yeni açılan şablon sayfasına yazın ve uygun kısıtlamaları tanımlayın.

Yeni oluşturulan kullanıcı tanımlı denklemi seçerek veri sayfasının değerlerini analiz edin. Yazılım ekranının sol tarafındaki sonuçlar bölümünün altında gösterilen hesaplanan yaklaşık değerlerin bulunduğu tabloyu açın. Bir Titrasyon ELISA için bu temsili mikrotitre plakasında, dönüştürülmüş alkalin fosfataz substratının sarı rengi, eklenen Rhodocetin konsantrasyonlarının azalmasıyla bağlı ascetant ligand miktarının azaldığını gösterir.

Rodoksetin içermeyen kuyucuklardaki renk eksikliği, düşük bir arka plan sinyalini gösterir. Yeni bir algoritma, eklenen Rhodocetin'in toplam konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak sinyali hesaplamak için 405 nanometrede fotometrik nicelemeden elde edilen ham verileri işler. Her bir reseptör formu için dört titrasyon eğrisi, tip ve mutant ise oldukça tekrarlanabilir ve neredeyse birbirini üst üste getirir.

Buna karşılık, iki titrasyon eğrisi grubu birbirinden net bir şekilde ayrılmıştır. Mutant alfa 2 A alanının titrasyon eğrileri daha yüksek Rhodosetin konsantrasyonlarına kaydırılır, bu da Rhodocetin'in mutasyona uğramış reseptöre daha düşük afinite ile bağlandığını gösterir. Sekiz titrasyon eğrisinin ayrışma sabitleri, alfa 2 A alanının vahşi tip ve mutant formu için çizildi ve gruplandırıldı.

Rhodocetin'in vahşi tip alfa 2 A alanına bağlanması için afinite sabiti 5.80 artı veya eksi 0.15 nanomolar iken, Rhodocetin mutasyona uğramış reseptöre 9.68 artı veya eksi 0.18 nanomolar önemli ölçüde daha düşük bir afinite ile bağlanır. Rutin için optimize edildikten sonra, bu teknik altı ila yedi saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, glutaraldehitin reseptöre ligand bağlanmasını etkileyebileceğini ve ligandın epitoplarına zarar verebileceğini ve böylece antikor tespitini tehlikeye atabileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu önceden test edilmelidir. Yüzey plazma rezonansı için ekipman mevcutsa, SPR yöntemi bir alternatif olarak kullanılabilir, ancak SPR, afinite sabitini belirlemek için kinetik verileri değerlendirir. Bu Titrasyon ELISA, yeni değerlendirme algoritması ile birlikte çok yönlüdür ve örneğin, yapı aktivite ilişkilerini analiz etmek ve protein-ligand etkileşimlerinin molekül mekanizmasını çözmek için farklı ligandların afinitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, Titrasyon ELISA'nın nasıl gerçekleştirileceğini ve bu yeni değerlendirme algoritmasının nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız, böylece herhangi bir protein-ligand etkileşimi için afinite sabiti, aynı anda birden fazla ligand için bile kolay ve rutin olarak belirlenebilir. Glutaraldehit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, bu protokolün sabitleme adımı gerçekleştirilirken eldiven ve gözlük takmak gibi güvenlik önlemleri her zaman alınmalıdır.