Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da interação planta-micróbio. Você pode, por exemplo, identificar genes importantes de cepas bacterianas que foram isoladas da endosfera ou rizosfera durante a interação da bactéria com a planta. É um método versátil que também pode ser usado para estudos sobre outras bactérias com plantas.

A principal vantagem dessa técnica é que, em um período relativamente curto, um grande número de genes de bactérias importantes durante as interações planta-micróbio pode ser identificado. Para iniciar este procedimento, enxágue a superfície da batata com água estéril. Banhe a batata em etanol a 70% por cinco minutos e depois em hipoclorito de sódio a 3% por mais cinco minutos.

Depois, enxágue novamente com água estéril para remover qualquer hipoclorito de sódio restante. Em seguida, prepare os materiais necessários para germinar e cultivar tubérculos de batata. Esterilize os potes de plástico, cestos de enxerto, vermiculita e água autoclavando-os a 121 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, coloque a batata esterilizada na superfície na cesta de enxerto e coloque-a em um pote autoclavado contendo vermiculita úmida. Use uma grande caixa de fibra de vidro para cobrir o pote para evitar contaminações microbianas. Mantenha a panela em uma câmara climática a 24 graus Celsius por três semanas e coloque-a em ciclos de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão.

Para coletar os exsudatos da raiz da batata, quando os brotos brotarem, transfira a cesta com a batata inteira para um copo esterilizado cheio de 150 mililitros de água deionizada autoclavada com os tubérculos de batata colocados logo acima da superfície da água e as raízes submersas na água. Mantenha a muda na câmara climática e use as mesmas configurações de antes. A partir do segundo dia, recolher a água que contém os exsudados e encher novamente o copo com água esterilizada e desionizada.

Em seguida, armazene cada amostra separadamente a quatro graus Celsius. Para cada amostra, espalhe 100 microlitros em uma placa de ágar Luria-Bertani para verificar se há contaminações microbianas. Descarte as amostras contaminadas.

Combine as amostras coletadas de uma muda. Em seguida, transfira os exsudatos radiculares combinados para tubos de 50 mililitros. Congele os tubos contendo exsudatos radiculares a 80 graus Celsius negativos.

Concentre-os liofilizando-os a 40 graus Celsius negativos até um volume final de 150 mililitros. Para cultivar a bactéria, listre uma cepa de B. mycoides de um estoque de glicerol de 80 graus Celsius negativos em uma placa de ágar LB e incube a placa a 30 graus Celsius durante a noite. Em seguida, inocule o meio líquido LB com uma única colônia da placa e cultive a cultura em uma incubadora agitada a 200 rpm durante a noite a 30 graus Celsius.

Para tratar e amostrar as bactérias, diluir uma cultura de B. mycoides durante a noite com 90 mililitros de meio LB pré-aquecido até o OD600 inicial de zero vírgula zero cinco em um frasco de 300 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de exsudatos radiculares à cultura e use um tratamento de água deionizada estéril de 10 mililitros como controle. Em seguida, incube-os a 30 graus Celsius por uma hora.

Após uma hora, transfira a cultura para tubos de centrífuga de 50 mililitros. Coletar as células da cultura por centrifugação a 9.000 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius. Depois, descarte o sobrenatente e congele imediatamente o pellet em nitrogênio líquido.

Em seguida, armazene-o a menos 80 graus Celsius até o uso. Para isolar o RNA, descongele os grânulos celulares no gelo e suspenda cada um deles em 400 microlitros de tampão TE. Em seguida, transfira as suspensões para os tubos de tampa de rosca de dois mililitros.

Adicione cinco gramas de contas de vidro no tubo. Em seguida, feche as tampas com firmeza e coloque os tubos em um homogeneizador de moinho de esferas. Realize uma homogeneização de pulso de 45 segundos três vezes, com um intervalo de um minuto no gelo.

Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos a 11.000 vezes G e transfira a fase superior de cada amostra para um novo tubo. Adicione 500 microlitros de clorofórmio: álcool isoamílico à fase superior e centrifugue a mistura por cinco minutos a 11.000 vezes G. Em seguida, transfira 500 microlitros da fase superior para um tubo novo. Adicione um mililitro do tampão de ligação de lise e misture-o pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, prepare tubos de microcentrífuga de um vírgula cinco mililitros com 100 microlitros de tampão DNase, 10 microlitros de DNase I e cinco microlitros de um inibidor de RNase. Adicione a mistura de solução preparada no filtro dos tubos de filtro e incube-os por 20 a 30 minutos a 15 a 25 graus Celsius. Posteriormente, execute as etapas de lavagem de acordo com as instruções do fabricante e adicione 50 microlitros de um tampão de ilusão ao tubo.

Após centrifugação, eluir o RNA. Transfira alguns microlitros da amostra para um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros de um ponto para realizar uma verificação de qualidade. Finalmente, cubra o RNA iludido com um filme plástico de parafina e mantenha-o a menos 80 graus Celsius.

Após a coleta, os exsudatos radiculares foram adicionados à cultura de B. mycoides na proporção de 10%, e o RNA total bacteriano foi isolado. O RNA foi então submetido a uma verificação de qualidade por um instrumento automatizado de eletroforese. Esses gráficos representam o RNA isolado de B. mycoides tratado com os exsudatos radiculares, e esses gráficos representam o RNA isolado do grupo controle.

Todas as amostras obtiveram um valor de RIN acima de nove, com duas bandas claras correspondentes às subunidades de RNA 16S e 23S, demonstrando que o RNA de alta qualidade foi obtido por este protocolo. Após a preparação da biblioteca, as leituras finais dos pares foram obtidas com uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento. As leituras brutas de RNA-seq foram cortadas das sequências adaptadoras e mapeadas em relação à sequência do genoma de referência.

A análise caseira do transcrito foi realizada com o pipeline T-REx, e o gráfico de intensidade da razão de todos os genes diferencialmente expressos é mostrado aqui. Após a identificação do gene potencialmente importante, outros métodos in vivo, como fusão GFP do promotor, cue-pews-air e hibridização in situ fluorescente, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o tempo de expressão reservada de certos genes durante a interação com a planta hospedeira.