Analisi digitale dell'immunostaining delle proteine che interagiscono con la W10 nei tessuti polmonari umani

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel patologico e nell'immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica è abbastanza veloce e che produce supporti digitali di alta qualità. Inizia fissando un campione di tessuto kung di tre per tre centimetri in paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, disidratare il tessuto in immersioni ascendenti di etanolo a temperatura ambiente, seguito da tre immersioni in xilene al 100% per 20 minuti per trattamento. Dopo l'ultima immersione in xilene, posizionare il tessuto in paraffina Celsius di 63 gradi per 30 minuti, seguito da una seconda immersione di 45 minuti in paraffina fresca celsius di 63 gradi, quindi cambiare la paraffina un'altra volta per un'incubazione finale di un'ora. Quando la paraffina si è raffreddata, utilizzare un microtomo rotante per acquisire cinque sezioni spesse un micrometro del campione di tessuto incorporato nella paraffina, catturando le sezioni su scivoli rivestiti in poli-L-lisina da 20 microgrammi per millilitro.

Per la dewaxing, posizionare gli scivoli in un forno Celsius di 65 gradi per due ore, seguito da immersione in dimetilbenzene per 15 minuti e immergersi nel 100% di xilene per 15 minuti, quindi reidratare le diapositive in una serie di immersione in etanolo discendente. Per la riparazione dell'antigene, posizionare le diapositive in una scatola antigene e aggiungere 300 millilitri di liquido di riparazione dell'acido citrico alla scatola. Riscaldare la scatola in un forno a microonde ad alta potenza per due minuti, seguita dal riscaldamento a bassa potenza per sostenere l'ebollizione per sei minuti.

Quando le diapositive si sono raffreddate a temperatura ambiente, lavare i campioni di tessuto con tre lavaggi PBS molare da cinque minuti 0,01 in uno shaker rotante a temperatura ambiente. Per eliminare la perossidasi endogena, incubare i vetrini con perossido di idrogeno al 3% in acqua doppia distillata per 30 minuti in una scatola bagnata a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le diapositive come dimostrato e collegare qualsiasi legame non specifico su ogni sezione con 100 microlitri di siero di capra al 10% per 39 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, etichettare i tessuti con 100 microlitri di anticorpo anti-ZWINT per scivolo a quattro gradi Celsius durante la notte, seguito da tre lavaggi in PBS molare 0,01. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i vetrini con un anticorpo secondario appropriato per 30 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da tre lavaggi PBS molare 0,01. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere gli scivoli a 300 microlitri di DAB fresco per 10 minuti, seguiti da un lavaggio di 10 secondi con acqua del rubinetto a temperatura ambiente.

I contatori macchiano i tessuti con soluzione di colorazione dell'ematossilina per due minuti a temperatura ambiente, seguiti dal lavaggio in acqua del rubinetto per 15 minuti, quindi disidratano nuovamente il tessuto in immersioni ascendenti all'etanolo, seguite da due immersioni di 15 minuti in xilene a temperatura ambiente. Dopo l'ultima immersione al 100% di etanolo, montare le sezioni con 15 microlitri di uno xilene al 5% in soluzione gengivale neutra e coprire ogni campione di tessuto con un vetro di copertura. Per la scansione automatica a scorrimento intero delle sezioni, lasciare prima asciugare le diapositive a temperatura ambiente per 12 ore per essiccare i campioni di tessuto.

Successivamente, nello scanner automatico a scorrimento intero, selezionare Brightfield manualmente e immettere l'interfaccia di scansione manuale. Rivedere il nome delle diapositive e selezionare un percorso di archiviazione per le immagini. Impostare l'area di scansione e selezionare gli esempi di analisi utilizzando l'opzione Imposta soglie utente.

La soglia è di circa 50 con un valore di espansione dell'area di scansione di 200 micrometri. Impostare il valore dello stato attivo della scansione e selezionare Messa a fuoco automatica e modalità a livello singolo, quindi caricare le diapositive nella stazione di lavoro e avviare la scansione automatica. Dopo aver analizzato tutte le diapositive, salvare le immagini per un'analisi successiva.

Per analizzare le immagini delle sezioni del tessuto polmonare, aprire il software istopatologico di analisi delle immagini e selezionare Computer locale per aprire il file con i dati di scansione. Selezionate il livello di zoom appropriato e usate Attiva/disattiva regolazione colore per impostare il colore sul contrasto ottimale, quindi cerchiate e nominate le aree di interesse su ogni immagine. Successivamente, in plugin, selezionare QC. Verrà visualizzato Il Generatore di scenari.

Selezionate Quant densità (Density Quant) e regolate la barra di rilevamento. Regolare i livelli di punteggio fino a quando l'intensità di colorazione delle aree cerchiate è simile a quella delle immagini originali e archiviare e denominare il modello come nuovo file, quindi applicare il modello ad altre diapositive e selezionare Annotazione selezionata per lasciare che il software calcoli automaticamente il punteggio APE per le aree di interesse in ogni immagine. La scansione digitale a scorrimento intero di sezioni di tessuto polmonare di tumori e tessuti non tumorali adiacenti da campioni di cancro ai polmoni non a piccole cellule produce immagini digitali di alta qualità.

I punteggi APE calcolati da questi tipi di campioni di cancro ai polmoni sono in genere significativamente più alti di quelli determinati per i tessuti non tumorali adiacenti. Inoltre, i livelli di espressione ZWINT nelle sezioni del tessuto carcinoma a cellule squamose sono spesso determinati come significativamente superiori a quelli misurati in campioni di tessuto di abnocarcinoma. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prepararsi con alta qualità delle aree tumorali o tumorali durante la scansione patologica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi della microscopia per rispondere a domande aggiuntive. Né il metodo o il metodo diverso per la scansione patologica. Dopo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della scansione patologica per esplorare la diagnostica digitale nello scopo della ricerca.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e precauzioni come le maschere dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.