출처: 케이 스튜어트, RVT, RLATG, CMAR; 발레리 A. 슈뢰더, RVT, RLATG. 노틀담 대학교, IN
혈액 수집은 마우스와 쥐를 관련시키는 연구 결과를 위한 일반적인 요구 사항입니다. 마우스와 쥐의 혈액 철수 방법은 필요한 혈액의 부피, 샘플링 빈도, 피를 흘릴 동물의 건강 상태 및 기술자의 기술 수준에 따라 달라집니다. 1 모든 방법은 복고풍 궤도 부비동 출혈, 초기 꼬리 스니핑 출혈 및 심장 내 출혈에 대해 논의하여 전신 마취의 사용을 요구합니다.
출혈 절차에 앞서 필요한 샘플 유형을 결정해야 합니다. 실험 절차는 전혈, 혈장 또는 혈청을 요구할 수 있었습니다. 전혈의 경우 항응고제를 시료에 첨가해야 합니다. 적혈구로부터 분리될 때 피브리뇨유발 물질 및 기타 응고 인자를 포함하는 플라즈마는 항응고식 시료로부터 추출될 수 있다. 혈청은 항응고제없이 혈액 수집을 통해 수득된다. 혈전은 응고가 형성되면 시료의 원심 분리로 인해 발생합니다. 샘플이 응고된 바와 같이, 혈청은 피브리노겐 또는 다른 응고 인자를 포함하지 않습니다. 플라즈마와 혈청 은 최소 15 분 동안 2200-2500 RPM에서 원심 분리기 실행을 사용하여 얻을 수 있습니다.
전혈 또는 혈을 산출해야 하는 시료의 경우 적절한 항응고제를 사용해야 합니다. 실험실 동물에 대 한 일반적으로 사용 되는 항 응 고제는 heparin, 화분 나트륨, 그리고 에틸렌디아민 테트라 아 세트 산 (EDTA); 그 중 선택은 연구 요구에 기초합니다. EDTA, 헤파린 및 구연산 나트륨의 액체 형태인 분리기는 주사기에 직접 적재하여 표면을 코팅할 수 있습니다. 이것은 혈액이 그려질 때 항응고제의 접촉을 직접 허용하고 응고의 예방을 돕습니다. 쥐 혈전은 대부분의 포유류 혈액 보다 빠른, 혈액에 항 응고제의 정확한 비율은 혈액 수집에 사용 하는 것이 필수적이다.
바늘 선택은 동물의 크기와 정맥의 부위를 기반으로합니다. 일반적으로, 바늘의 보어가 클수록 시료를 더 빠르게 수집할 수 있다. 혈액 세포에 적은 손상은 더 큰 바늘에 또 다른 이점. 그러나, 큰 보어 바늘에 주요 단점은 선박에 잠재적인 손상이다. 쥐와 쥐에, 크기의 선택은 길이0.5-1.5 인치 20-29 게이지 바늘에서 범위. 바늘이 너무 길면 사용하기가 어색할뿐만 아니라 바늘에 여분의 공간이 있으면 응고될 수 있습니다. 적절한 바늘 크기는 절차 섹션의 각 방법에 대해 나열됩니다.
필요한 샘플의 크기도 미리 결정되어야 합니다. 마우스 또는 쥐의 작은 크기로 인해 생존 출혈을 위해 최대 양의 혈액 수집량을 계산해야합니다. 무게 평균 마우스 25 그램의 총 혈액 볼륨1.8 ml; 무게 평균 쥐 250 그램의 총 혈액 볼륨16 ml. 유체 교체없이 마우스 또는 쥐의 단일 혈액 샘플의 경우, 안전하게 제거 할 수있는 최대 혈액 부피는 총 혈액 부피의 10 % 또는 7.7-8 μl/g입니다. 따라서 평균 마우스의 경우 혈액 부피의 10 %가 193-200 μl입니다. 250 그램의 평균 쥐의 경우, 이것은 1.9-2.0 ml에 해당합니다. 연구 결과는 혈액 부피의 15% 이상을 제거하는 것이 저혈당 충격을 일으키는 원인이 될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 1,2 그러나 유체 교체를 통해 전체 혈액 부피의 최대 15 % 또는 12 μl /g-를 제거 할 수 있습니다. 25그램 마우스의 경우 300 μl과 같습니다. 250 그램 쥐의 경우 3 ml에 해당합니다. 유체 교체를 위해 유체를 따뜻하게 하고 피하로 주어져야 합니다.
여러 샘플을 복용해야 하는 경우, 그려진 혈액 량이 줄어듭니다. 주당 그릴 수 있는 최대 혈액 부피는 총 혈액 부피의 7.5% 또는 6 μl/g 이하입니다. 25그램 마우스의 경우 주당 145-150 μl과 같습니다. 250 그램 쥐의 경우, 이것은 주당 1.45-1.50 ml에 해당합니다. 샘플링이 2주마다 발생하면 총 혈액 부피(8 μl/g)의 최대 10%까지 추출될 수 있습니다. 이는 평균 마우스의 경우 2주마다 200 μl, 250그램 쥐의 경우 2주마다 최대 2.00ml에 해당합니다. 한 연구, 의 평균 무게를 가진 쥐에 수행 250 그램, 15-20%의 혈액 볼륨을 제거 될 때, 그것은 이상 했다 29 정상화 혈액 수준에 대 한 일. 1,2 반복혈액 수집의 경우, 체액 교체는 부피만 대체하기 때문에 더 큰 혈액 량 또는 더 빈번한 혈액 수집을 허용하지 않습니다. 동물은 혈액 세포를 보충하는 시간이 필요합니다.
복고풍 궤도 신경총의 사용은 과거에 일반적인 관행이었다. 그러나, 이 절차의 인도성에 관하여 많은 관심사가 생겼습니다. 시술 도중, 눈의 내측 캔투스에 한 번 놓인 혈종 관의 과도한 움직임은 눈꺼풀 및/또는 결막의 팽윤귀결과로 주변 조직에 손상을 입힐 수 있습니다. 부은 조직은 눈꺼풀의 폐쇄가 방해되도록 안구가 충분히 튀어 나오게 할 수 있으므로 각막 건조 및 손상이 발생할 수 있습니다. 팽윤으로 인한 통증은 눈의 에클레오싱을 초래하는 긁힘과 자기 절단을 유발할 수 있습니다. 복고풍 궤도 출혈 동안 헤마토크 튜브의 부적절한 배치는 시신경을 끊을 수 있으며 실명증을 초래할 수 있습니다. 헤마토크릿 튜브가 부적절한 각도로 진행되면 눈을 강제로 궤도 밖으로 내밀어 눈꺼풀이 눈알 뒤에 떨어질 수 있습니다. 이 경우 눈을 소켓으로 올바르게 교체하기가 매우 어렵습니다. 발생할 수 있는 다른 문제는 깨지기 쉬운 궤도 뼈의 골절, 유리체 유머의 손실을 초래하는 눈 지구의 침투, 또는 눈과 주변 구조물에 대한 압력으로 인해 극심한 통증을 초래할 수 있는 눈 뒤에 혈종의 형성을 포함합니다. 이러한 모든 우려에도 불구하고, 숙련 된 기술자가 절차를 수행하고 동물이 이소플루란 흡입 마취와 같은 전신 마취로 완전히 마취되면 복고풍 궤도 출혈은 설치류에서 혈액 수집의 효과적인 방법으로 나타났습니다.
궤도 영역의 해부학 적 구조는 마우스와 쥐 사이에 다릅니다. 마우스는 궤도 지역에 부비동을 만드는 선박의 복고풍 궤도 부비동 – 컬렉션을 가지고있다. 쥐 눈의 궤도에, 그 눈 뒤에 흐르는 선박의 신경총이있다; 그러나 마우스와 같이 부비동을 형성하지 않습니다. 따라서 마우스에서이 절차를 수행하는 것이 더 쉽습니다. 복고풍 궤도 신경총을 통한 반복 샘플링 컬렉션의 경우, 피리 사이의 최소 10일이 필요하며, 이 지역의 조직이 치유될 수 있도록 허용해야 합니다. 전신 마취가 권장되지만, 프로파라카인 이나 테트라카인과 같은 국소 안과 마취가 시술 전에 적용되는 경우 전신 마취없이 마우스에서 시술을 수행 할 수 있습니다. 쥐는 복고풍 궤도 부비동을 가지고 있지 않기 때문에, 궤도 주위의 그들의 막이 훨씬 강하기 때문에,이 절차를 위해 그들을 마취하는 것이 필수적입니다.
작은 볼륨의 직렬 샘플은 꼬리 클립 방법을 사용하여 얻을 수 있습니다. 꼬리의 초기 절단은 꼬리 끝, 마우스의 길이 약 0.5-1.0 mm 및 쥐의 2.0 mm로 제한되어야합니다. 1 혈액 수집을위한 꼬리 스니핑 절차는 꼬리 끝에 원래 컷의 딱지 또는 응고를 방해하여 연속 수집을 허용합니다. 일반적으로 꼬리 끝의 추가 절단은 필요하지 않습니다. 수집된 혈액의 양은 마우스를 위한 20-100 μL 및 쥐를 위한 75-150 μL에서 구역 수색합니다. 수집된 양은 동물 들 사이에서 가변적이며 나이, 건강 상태 및 체중에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
꼬리 스닙에서 채취한 샘플에는 조직 제품 오염과 함께 동맥 및 정맥 혈액이 모두 포함될 수 있습니다. 꼬리가 쓰다듬거나 “착유”되면 샘플 품질이 감소하여 더 많은 혈액을 얻습니다. 혈류를 증가시키기 위해 꼬리는 따뜻한 압축, 열램프 또는 따뜻한 물에 침수하여 가열 할 수 있습니다. 기압은 최면에 대한 꼬리 팁에 적용되어야하며, 동물은 자혈이 달성되었는지 확인하기 위해 5-10 분마다 확인해야합니다. Hemostasis는 종종 반복 샘플링으로 지연됩니다. 스티피틱 파우더는 혈전증에 사용될 수 있다. 초기 절단의 경우 마취(일반 또는 현지)를 권장합니다. 후속 출혈은 마취를 필요로하지 않아야하며, 특히 동물이 절차에 습관화될 때. 마취는 혈압의 하락을 일으킬 것입니다, 어려운이 기술로 혈액 수집을 만들기.
꼬리 스니핑의 대안은 꼬리 용기 닉입니다. 이 절차는 마우스와 쥐 모두에서 쉽게 수행됩니다. 그러나 꼬리 스니핑과 마찬가지로 샘플은 특히 마우스에서 조직 제품으로 오염될 수 있습니다. 쥐의 경우 피하 바늘이 용기에 삽입되고 바늘의 허브에서 혈액이 수집됩니다. 한 연구는 혈액 수집을 돕기 위해 바늘 천자 부위 위에 배치 된 지혈대의 사용을 입증했다. 3 주사기로 인한 압력이 혈관을 무너질 것이기 때문에 주사기는 혈관에서 혈액을 끌어내는 데 사용되지 않습니다. 이 방법은 또한 연재 샘플링에 사용할 수 있습니다., 혈전을 제거 할 수 있습니다 다시 출혈 사이트를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 꼬리 스닙과 마찬가지로, 부위에 압력을 가하고 5-10분마다 동물을 다시 검사하여 혈전을 보장하는 것이 필수적입니다.
종종, 연구는 비 생존을 필요로, 내심 출혈 또는 caudal 베나 카바를 통해 흥분을 통해 수집되는 큰 혈액 샘플. 4 총 혈액 량의 약 절반은 심장 펑크에 의해 마우스 또는 쥐로부터 수집될 수 있다. 이는 평균 25그램 마우스의 경우 40 μl/g 또는 약 1ml에 해당합니다. 250 그램 쥐는 약 10 ml의 혈액을 낳을 것입니다. 동물은 멸시를 위해 마취되어야 합니다. 흡입성 마취 또는 CO2 마약은 숙련 된 기술자에 의해 사용될 수있다; 주사용 마취도 사용할 수 있습니다. 그러나, 혈압과 순환에 있는 감소가 있을 수 있습니다., 수집 된 혈액의 양을 줄일 수 있는.
caudal vena cava 방법은 동물이 외과적으로 혈관을 드러내기 위하여 깊이 마취될 것을 요구합니다. CO2 나르코시스는 심장이 뛰고 혈액 철수 중에 동물이 호흡해야하기 때문에 충분하지 않습니다. 절차 도중, 혈액 철수의 너무 급속한 것은 구멍의 bevel에 있는 혈관을 붕괴시키는 원인이 될 수 있습니다, 개구부를 가리고 혈액 수집을 방지하. 또한 혈관 벽은 얇기 때문에 바늘 입구 부위로부터 혈액이 파열되거나 누출되는 것을 방지하기 위해 손과 바늘의 움직임을 피해야 한다. 바늘이 피부를 통과하지 못하기 때문에, 이 방법은 멸균 샘플의 수집을 초래한다. 부막제 안락사 방법은 동물이 마취에서 회복되지 않도록 하기 위해 사용되어야 합니다. 이 방법은 종종 심장 또는 대동맥 관류다음에.
상기 심내 방법은 마취(closed method)가 되면 동물을 수동으로 절제하거나, 심장이 카우달 베나 카바 혈액 수집 방법(open method)에 대한 프로토콜에 따라 외과적으로 노출될 수 있다. 폐쇄 된 방법의 경우, 바늘 배치의 랜드 마크는 동물의 왼쪽에, xiphoid 과정에서 늑골 케이지에 의해 형성 된 홈입니다.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
