Canlı görselleştirme Drosophila Glial nöromüsküler Kavşağı
Summary
Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.
Abstract
Projemiz, gelişmekte olan larva, sinek nöromüsküler sinaps GFP etiketli glial yapıları belirledi. Canlı glial-sinir-kas sinaps geliştirme bakmak için canlı bozulmamış larvalarının özellikleri olan bir larva doku hazırlama geliştirdi, ama aynı zamanda iyi bir optik özellikleri vardı. Bu yeni hazırlık sinaps guruplarına erişim için izin verdi. Biz, sinek larvaları kullanılan yapay hemolimf onları dalmış ve onları ürpertici normal ritmik vücut kasılmaları rahat. Sonra her bir hayvanın arka kesimlerine disseke ve künt bir böcek iğne ile vücut boşluğu yoluyla ağız parça geriye itti. Bu çorap, iç-dış torna gibi, larva vücut duvarının dışa dönük. Biz ultra-ince diseksiyon diseksiyon makas ile tamamladı ve böylece vücut duvarı kasları visseral yan maruz. NMJ glial yapıları glial özel yararlanıcı kontrolü altında membran hedeflenen GFP dile getirdi. Kas post-sinaptik membran, SSR (Subsynaptic Reticula) synaptically dsRed hedef dile getirdi. Biz akut motor nöron terminalleri, sinaps üçüncü bölümü etiket gerekiyordu. Bunu yapmak için çok kırmızı yayan flurophore konjuge primer antikor, HRP uygulanır. Motor nöron terminalleri ve SSR arasında perisynaptic uzaya boya difüzyon özellikleri test etmek için, uzak-kırmızı yayan flurophore ve toplanan görüntüleri konjuge büyük Dextran'ın moleküllerin bir çözüm uyguladı.
Protocol
Discussion
Bu prosedür, canlı etiketli proteinler ve hücre süreçlerinin uzun vadeli görüntüleme izin verir. Açıklanan in situ doku hazırlık ve işleyişi sağlam bir merkezi sinir sistemi, PNS ve refleks devreler vardır. Bu doku hazırlık larva vücut duvarı kas gergin standart larva, sinek kas protokolleri, (tutturulmuş.) Üzerinde avantajları vardır. Esneme sinaptik morfolojisi deforme ve refleks tabanlı kasılmaları tetikleyebilir. Hazırlık dışarı içinde mekanik olarak dayanıklı ve gerçek z…
Acknowledgements
Bu proje CIHR ve NSERC tarafından finanse edildi. Barb Jusiak dsRed etiketli SSR (BJ çizgi) ve UBC Biyo-görüntüleme Tesis ifade sinek suşlarının yaratılmasına katkıda bulunmak için kabul etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
