测量中使用FM标签的神经元的胞外分泌

Summary

囊泡释放动力学的能力来衡量，可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里，我们采用实时成像与红色荧光染料FM 4-64标记，以测量在海马神经元的文化突触前囊泡释放率的囊泡。

Abstract

囊泡释放动力学的能力来衡量，可以帮助提供洞察到一些神经递质的基础。在这里，我们使用实时成像与FM染料标记，以监测囊泡突触前囊泡释放率。 FM4 – 64是一个红色的荧光双亲苯乙烯染料嵌入到突触小泡的膜，内吞作用是刺激。亲脂相互作用导致的染料，大大提高了荧光，从而散发出耀眼的的信号时，囊泡和的名义，在细胞外液时相关。经过清洗的步骤是用来帮助去除质膜的内外部染料，其余的FM是集中在囊泡，然后被驱逐又一轮的电刺激诱导的胞外分泌时。囊泡释放率是测量荧光的产生减少。由于调频染料可以适用于外部和瞬时，它是一个有用的工具，用于确定在神经元文化的胞外分泌率，尤其是在比较之间转突触和相邻的控制boutons率。

Protocol

细胞：大鼠（或鼠标）海马（14-28天）在体外神经元文化。 刺激：电器，通过交付两个铂电极; 70-90毫伏显微镜的60X石油镜头：一个倒置的CCD荧光显微镜。 软件：Slidebook（智能成像创新，圣莫尼卡，加利福尼亚） 进一步详情请参阅页的补充方法 暖的HEPES缓冲液（HBS）至室温。添加谷氨酸受体拮抗?…

Discussion

300动作电位（AP）的是足以诱发囊泡循环至少有一个全面，装载了300接入点或更是经常给标签的囊泡回收池刺激。虽然更加激烈负荷刺激，如900的AP，可能会允许必须标明的其他囊泡的名义，这也增加了染料可以嵌入外膜的时间，从而导致更多的非特异性染色。我已经找到了清洗步骤是至关重​​要的，以确保正确的脱色。重要的是要灌注流速为每分钟1至1.5毫升，一般为10 + 2分钟。 〜7分钟后洗净，监察染料去?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
APV		Sigma	A5282
FM 4-64		Molecular Probes	T-3166
CNQX disodium salt		Sigma	C-239