דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה
Summary
הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.
Abstract
שלמה הר<em> באתרו</emהכלאה> היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה כפול פלורסנט<em> באתרו</em> הכלאה פרוטוקול לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. הפרוטוקול הוא גירסה שונה של תקן<em> באתרו</em> הכלאה באמצעות phosphatase אלקליין מצעים כגון NBT / BCIP ומהירה האדום<sup> 1,2</sup>. פרוטוקול זה מנצל תקן digoxygenin והעמסת בדיקות שכותרתו יחד עם הגברה אות tyramide (TSA)<sup> 3</sup>. ערכות זמינים מסחרית TSA לאפשר עיצוב ניסיוני גמישה כמו פליטת הקרינה מירוק עד אדום ניתן להשתמש בשילוב עם כתמים גרעיני שונים, כגון יודיד propidium, או אימונוהיסטוכימיה הקרינה של חלבונים. TSA מייצרת המצע פלורסנט תגובתי כי במהירות קוולנטית נקשר moieties, שאריות טירוזין בדרך כלל, בסביבה הקרובה של riboprobe antisense שכותרתו. דפוסי מכתים וכתוצאה מכך הם ברזולוציה גבוהה בלוקליזציה כי subcellular-mRNA ניתן לצפות באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal<sup> 3,4</sup>. אפשר לצפות תמלילי המתהווה על לוקוסים כרומוזומליות, להבדיל מכתים גרעיני cytoplasmic ולדמיין דפוסים אחרים כגון בלוקליזציה קליפת המוח של mRNA. מחקרים<em> תסיסנית</em> עולה כי כ 70% mRNAs התערוכה דפוסים ספציפיים של לוקליזציה subcellular כי לעתים קרובות לתאם עם הפונקציה של החלבון המקודד<sup> 5</sup>. בשילוב עם שחזור בעזרת מחשב של מערכי נתונים confocal 3D, פרוטוקול שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של חלוקת mRNA עם רזולוציה משנה הסלולר עוברי החולייתנים כולה.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול…
Acknowledgements
ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
