Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung
Summary
Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.
Abstract
Whole mount<em> In situ</em> Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-<em> In situ</em> Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Das Protokoll ist eine modifizierte Version der Standard-<em> In situ</em> Hybridisierung mit alkalischer Phosphatase und Substraten wie NBT / BCIP und Fast Red<sup> 1,2</sup>. Dieses Protokoll nutzt Standard Digoxygenin und Fluorescein markierten Sonden mit Tyramid Signalverstärkung (TSA)<sup> 3</sup>. Die im Handel erhältlichen TSA-Kits ermöglichen eine flexible experimentellen Design als Fluoreszenzemission von grün auf rot weit in Kombination mit verschiedenen nukleären Flecken, wie Propidiumiodid oder Fluoreszenz Immunhistochemie für Proteine verwendet werden. TSA erzeugt einen reaktiven fluoreszierenden Substrat, das schnell kovalent bindet an Einheiten, die typischerweise Tyrosinreste, in unmittelbarer Nähe des markierten antisense Ribosonde. Die daraus resultierende Färbungsmuster sind hochauflösende, dass subzelluläre Lokalisation der mRNA beobachtet mit konfokaler werden<sup> 3,4</sup>. Man kann werdenden Transkripte in der chromosomalen Loci zu beobachten, zu unterscheiden nukleare und zytoplasmatische Färbung und visualisieren anderen Mustern wie kortikale Lokalisation der mRNA. Studies in<em> Drosophila</em> Zeigen, dass rund 70% der mRNAs spezifische Muster der subzellulären Lokalisation, die häufig korrelieren mit der Funktion des kodierten Proteins aufweisen<sup> 5</sup>. In Verbindung mit Computer-Aided Rekonstruktion von 3D-konfokale Datensätze kombiniert, ermöglicht es unseren Protokoll der detaillierten Analyse der mRNA-Verteilung mit subzellulärer Auflösung in ganzen Wirbeltier-Embryonen.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten Arbeiten gut mit Sonden, die eine saubere starkes Signal nach Färbung für 30-45 Minuten in einem typischen alkalischen Phosphatase-vermittelte Reaktion zu geben. Vor Durchführung der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll haben wir immer prüfen unsere Sonden mit dem Standard nicht-fluoreszierenden Protokoll (sofern in ergänzendes Material zusammen mit der Sonde Synthese-Protokoll). Wir haben weniger Erfolg mit der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll hatte bei der Verw…
Acknowledgements
Wir möchten die Beiträge von Dörthe Jülich, Jennifer Runde und Andrew Mara in der Entwicklung dieses Protokoll bestätigen. Forschungsförderung durch die NICHD, die American Cancer Society und der March of Dimes zur Verfügung gestellt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
