Dendra2 Photoswitching door de borstklieren Imaging venster
Summary
Intravitale photoswitching en het bijhouden van Dendra2-gemerkte tumorcellen door de borstklieren Imaging Window is een techniek die ons in staat stelt om het imago van de metastatische gedrag van tumorcellen in de gekozen tumor micro-omgevingen op een tijdschaal van dagen.
Abstract
In het laatste decennium, intravitale microscopie van borsttumoren bij muizen en ratten op single-cell resolutie<sup> 1-4</sup> Heeft geleid tot belangrijke inzichten in de mechanismen van metastatische gedrag, zoals migratie, invasie en intravasation van tumorcellen<sup> 5, 6</sup>, Angiogenese<sup> 3</sup> En immuuncellen reactie<sup> 7-9</sup>. We hebben onlangs melding gemaakt van een techniek om de afbeelding orthotope mammacarcinomata over meerdere sessies intravitale imaging in levende muizen<sup> 10</sup>. Hiervoor hebben we een borstklieren Imaging Window (MIW) en geoptimaliseerd imaging parameters voor Dendra2<sup> 11</sup> Photoswitching en imaging<em> In vivo</em>. We beschrijven hier het protocol voor de productie van MIW, het inbrengen van de MIW op de top van een tumor en beeldvorming van de Dendra2-gemerkte tumorcellen met behulp van een custom-built imaging box. Dit protocol kan worden gebruikt om het imago van de metastatische gedrag van tumorcellen in verschillende micro-omgevingen in tumoren en zorgt voor de lange termijn in beeld brengen van de bloedvaten, tumorcellen en gastheercellen.
Protocol
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse Department of Defense (BC075554 naar BG en BC061403 naar DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 naar JvR; CA100324 tot JC, JES en JW; CA77522 aan JES, U54CA126511 naar JC en BG). Wij danken D. Entenberg voor hulp bij microscopie, M. Rottenkolber voor hulp in de fabricage van de imaging-box en J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) voor de F4/80 antilichaam.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS w/o Ca, Mg | Gibco | 14190-144 | ||
| Trypsin | Gibco | 25300 | ||
| HBSS | Gibco | 14025 | ||
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | Gibco | 11965 | ||
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter | # NDC 10019-773-40 | ||
| SCID mouse | NCI | N/A | ||
| Culture dishes | BD Falcon | 353003 | Custom Order | |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
