TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ रेटिना द्विध्रुवी कक्ष में इमेजिंग exocytosis
Summary
इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे लेबल और एकल synaptic पुटिका और सुनहरीमछली रेटिना द्विध्रुवी कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) का उपयोग कर कक्षों में exocytosis तस्करी कल्पना.
Abstract
कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) है कि फ्लोरोसेंट अणु है कि कांच के रूप में एक उच्च अपवर्तक सूचकांक पदार्थ करीबी रहे हैं की चुनिंदा इमेजिंग द्वारा कोशिका झिल्ली पर हो रहा घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है एक तकनीक है<sup> 1</sup>. इस अनुच्छेद में, हम रेटिना द्विध्रुवी सुनहरीमछली रेटिना से अलग कक्षों में synaptic vesicles की छवि exocytosis इस तकनीक को लागू. इन न्यूरॉन्स उनके बड़े अक्षतंतु टर्मिनलों के कारण इस तरह के अध्ययन के लिए बहुत उपयुक्त हैं. एक साथ द्विध्रुवी कोशिकाओं clamping पैच से, यह संभव है कि पूर्व synaptic वोल्टेज और synaptic रिहाई के बीच संबंधों की जांच<sup2,3></sup>. द्विध्रुवी सेल टर्मिनल के अंदर Synaptic vesicles द्वारा एक फ्लोरोसेंट रंजक (1-43 ® एफएम) के साथ लोड कर रहे हैं सह डाई और एक घंटी समाधान एक उच्च कश्मीर युक्त puffing<sup> +</sup> Synaptic टर्मिनलों पर एकाग्रता. यह कोशिकाओं depolarizes और glutamatergic vesicles में endocytosis और फलस्वरूप डाई तेज को बढ़ावा देने. अतिरिक्त डाई लगभग 30 मिनट के लिए दूर धोने के बाद, कोशिकाओं जा रहा है पैच clamped और एक 488 एनएम लेजर के साथ एक साथ imaged के लिए तैयार हैं. पैच विंदुक समाधान एक rhodamine आधारित पेप्टाइड है कि synaptic रिबन प्रोटीन ribeye चुनिंदा बांध<sup> 4</sup>, जिससे रिबन विशेष रूप से लेबलिंग जब टर्मिनलों एक 561 एनएम लेजर के साथ imaged हैं. यह सक्रिय क्षेत्रों की सटीक स्थानीयकरण और अतिरिक्त synaptic घटनाओं से synaptic की जुदाई की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
उद्देश्य प्रकार TIRF माइक्रोस्कोपी के लाभ कर रहे हैं कि एक) यह उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ के भीतर एक संकीर्ण क्षेत्र में उत्तेजना प्रकाश सीमित द्वारा उत्कृष्ट ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करता है, जिससे बाहर का ध्…
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान EY 14990 के द्वारा समर्थित किया गया था.
References
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