Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial
Summary
Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.
Abstract
Heterozigosidade em eucariotos diplóides muitas vezes faz estudos genéticos pesado. Métodos que produzir descendentes viáveis diplóide homozigoto diretamente de mulheres heterozigotas permitir que as fêmeas F1 mutagenizados para ser exibido diretamente para mutações deletérias em uma tela acelerado para frente genética. Streisinger et al.<sup> 1,2</sup> Descritos métodos para fazer gynogenetic zebrafish diplóide (homozigoto), ativando os ovos zebrafish com o esperma de luz ultravioleta e inativada prevenção, quer meiótica a segunda ou a primeira divisão celular zigóticos usando tratamentos físicos (calor ou pressão) que os microtúbulos deploymerize. A "pressão inicial" (EP) método bloqueia a meiose II, que ocorre logo após a fertilização. O método EP produz uma alta porcentagem de embriões viáveis que podem se desenvolver para adultos fértil de ambos os sexos. O método gera embriões que são homozigotos em todos os loci, exceto aqueles que foram separados de suas centrômero por recombinação durante a meiose I. homozigótica mutações são detectadas em embreagens PE, entre 50% para loci centromérica e menos de 1% para loci telomérica. Este método é reproduzida na íntegra do livro Zebrafish<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
É importante certificar-se que os embriões produzidos por este método são diplóides gynogenetic verdade. Como controles, gerar uma ninhada de ovos diplóides normal (mantendo de lado algum do esperma sem UV inativação) e uma embreagem de embriões haplóides (mantendo de lado uma ninhada de ovos fertilizados com esperma UV sem passar pelo procedimento EP). Menos 1 dia após a fertilização de embriões haplóides têm um eixo de corpo curto, cérebro e morfologia irregular somito. Haplóides não são viáveis ?…
Acknowledgements
Métodos de fertilização in vitro e diplóides gynogenetic foram desenvolvidos para zebrafish por Charline Walker no laboratório de George Streisinger na Universidade de Oregon nos anos 1970 e 1980. O método descrito aqui não é alterado a partir de protocolos Charline, que estão disponíveis na íntegra em O Livro Zebrafish 3.
Métodos de fertilização in vitro e diplóides gynogenetic foram desenvolvidos para zebrafish por Charline Walker no laboratório de George Streisinger na Universidade de Oregon nos anos 1970 e 1980. O método descrito aqui não é alterado a partir de protocolos Charline, que estão disponíveis na íntegra em O Livro Zebrafish 3.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma | |||
| Watch glass | ||||
| French Press | ||||
| Pressure cylinder | ||||
| Instant ocean | ||||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | |||
| UV cross-linker | ||||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
