Faire Zebrafish diploïdes gynogénétiques par Pression Early
Summary
C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.
Abstract
Hétérozygotie chez les eucaryotes diploïdes fait souvent des études génétiques lourdes. Les méthodes qui produisent des descendants viables diploïdes homozygotes directement à partir de femelles hétérozygotes permettent F1 femelles mutagénisées à être projeté directement mutations délétères dans un écran accélérée avant génétique. Streisinger et al.<sup> 1,2</sup> Décrit des méthodes pour rendre le poisson-zèbre gynogénétiques diploïde (homozygote) en activant œufs de poisson zèbre avec la lumière ultraviolette inactivé sperme et la prévention soit la deuxième ou la méiose de la première division cellulaire zygotique utilisant des traitements physiques (chaleur ou la pression) que les microtubules deploymerize. La "pression précoce» (EP) bloque la méthode II de la méiose, qui survient peu après la fécondation. La méthode EP produit un pourcentage élevé d'embryons viables qui peuvent se développer à des adultes fertiles des deux sexes. La méthode génère des embryons qui sont homozygotes à tous les loci, sauf ceux qui ont été séparés de leur centromère par recombinaison durant la méiose I. mutations homozygotes sont détectés dans les embrayages PE entre 50% pour les loci centromérique et moins de 1% pour les loci télomériques. Cette méthode est reproduite textuellement du livre Zebrafish<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
Il est important de s'assurer que les embryons produits par cette méthode sont diploïdes gynogénétiques vrai. Comme contrôles, de générer une couvée d'oeufs diploïdes normales (en gardant de côté certaines de sperme sans UV-inactivation) et un embrayage d'embryons haploïdes (en gardant de côté une couvée d'oeufs fécondés avec le sperme UV sans passer par la procédure du PE). Au 1er embryons après la fécondation haploïde jour ont un axe corps court, le cerveau et la morphologie irrég…
Acknowledgements
Les méthodes de fécondation in vitro et diploïdes gynogénétiques ont été développés pour le poisson-zèbre par Charline Walker dans le laboratoire de George Streisinger à l'Université de l'Oregon dans les années 1970 et 1980. La méthode décrite ici est inchangé par rapport à des protocoles Charline, qui sont disponibles dans leur intégralité dans le Livre Zebrafish 3.
Les méthodes de fécondation in vitro et diploïdes gynogénétiques ont été développés pour le poisson-zèbre par Charline Walker dans le laboratoire de George Streisinger à l'Université de l'Oregon dans les années 1970 et 1980. La méthode décrite ici est inchangé par rapport à des protocoles Charline, qui sont disponibles dans leur intégralité dans le Livre Zebrafish 3.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma | |||
| Watch glass | ||||
| French Press | ||||
| Pressure cylinder | ||||
| Instant ocean | ||||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | |||
| UV cross-linker | ||||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
