A. biotinilazione del DNA DNA plasmidico sono state covalentemente biotinilato con guanina-specifiche etichette biotina, come descritto dal produttore (Mirus Bio, Madison, WI), ma in scala di avere ~ 1-2 etichette biotina al DNA. DNA plasmidico (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) è stato etichettato in questo protocollo. Sciogliere quantità desiderata di PDNA in TE buffer di DNasi e senza RNasi-free (biologia molecolare-grado di qualità) di acqua per ottenere una soluzione 1μg/μL DNA. Condurre la reazione di marcatura usando le miscele di reazione seguente. Aggiungere l'etichetta IT reagente scorso. Per reazione il DNA 100μg: DNasi RNasi-free e senza acqua 75 microlitri Etichettatura Buffer 10X A 20 l 1μg/μL DNA 100 ul Etichetta IT reagente 5 microlitri Volume totale 200 l Incubare la reazione a 37 ° C per 1 ora. Purificare il campione etichettato da etanolo o isopropanolo precipitazione seguenti protocolli standard. Nota: le colonne di filtrazione gel a base può portare ad assorbimento UV ad alta o fluorescenza di fondo, che possono influenzare la quantificazione del DNA o la caratterizzazione fluorescenza. Nota: Il livello di biotinilazione può essere determinata da HABA a base di test. B. Etichettatura dei Cy5-polimeri cationici Chitosano (390 kDa, 83,5% deacetilata, Vanson, Redmond, WA) è stato utilizzato come modello di un polimero cationico in questo studio. Le ammine primarie libero sulla dorsale chitosano polimero sono stati etichettati con Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Per facilitare la coniugazione completa di Cy5 colorante, calcolare in modo tale che il rapporto molare tra Cy5 la quantità richiesta di Cy5-SSN: ammine primarie è di 1: 200. Regolare il pH della soluzione di chitosano (in tampone acetato 25mM) per ~ 6,5 con l'aggiunta di NaOH. Si noti che la reazione NHS è più efficiente a pH basico, ma la solubilità del chitosano qui limita l'intervallo di pH di lavoro. Sotto agitazione, aggiungere lentamente la quantità calcolata di Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) alla soluzione chitosano in una goccia a goccia modo. Agitare la miscela al buio a temperatura ambiente per una notte. Per purificare, Dializzare con 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) per 2 ore contro tampone acetato 1% a temperatura ambiente al buio. Sostituire il tampone e Dializzare altre 2 ore a temperatura ambiente al buio. Sostituire il tampone e Dializzare notte a 4 ° C al buio. Conservare purificato etichettati polimero a -20 ° C. Nota: In questo studio, una curva standard è costruito misurando l'intensità di emissione di Cy5-NHS estere a 670 nm. Caratterizzano la densità etichettatura misurando l'emissione ottenuti a 670 nm da Cy5 marcato chitosano nella curva standard. Assorbanza può anche essere usato per determinare l'efficienza etichettatura, ma non è stato eseguito qui. Preparazione C. QD marcato DNA e Cy5-Polymer Il rapporto molare di PDNA di QD è stato mantenuto in eccesso (PDNA: QD ≈ 1: 2) per garantire la coniugazione completa di QD di PDNA. Il numero di QD etichetta su ogni PDNA può essere stimata attraverso immagini TEM o altre strutture equivalenti. Nel nostro studio, il numero di QD per PDNA è stimato in ~ 1-3 da TEM e spettroscopia di singola molecola. 1 Utilizzare Millipore Milli-Q acqua pendenza (> 18,0 MW, 0.2um filtrata) durante la preparazione. Calcolare la quantità di chitosano per 10μg PDNA secondo desiderato N / P, il rapporto teorico di ammine protonate nella soluzione di chitosano per i fosfati negativo nella soluzione del DNA. Aggiungi streptavidina-funzionalizzati 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) nella soluzione biotinilato PDNA. Incubare la soluzione a temperatura ambiente al buio per 15 min. Aggiungere il QD marcato DNA in 50 mM soluzione di solfato di sodio per rendere il volume finale 200μL. Diluire Cy5-chitosano, secondo desiderato N / P, con acqua Milli-Q per rendere il volume finale 200μL. Nota: Tenere la reazione di scuro per impedire alla photobleaching possibile. Importante: Siate cauti di utilizzare il Qdot 605 ITK ™ streptavidina coniugato (la serie ITK), come Punti quantici in questo catalogo sono progettati per lo scopo di FRET. La serie Qdot regolari sono coniugati con uno strato PEG per evitare legame non specifico, in particolare per l'etichettatura cellulare. Tuttavia, questa ulteriore rivestimento allarga il donatore-accettore distanza, con conseguente reduced trasferimento di efficienza energetica. D. Realizzazione della SU-8 Masters Utilizzando Fotolitografia standard Wafer di silicio è piranha pulito e cotto a 200 ° C per 5 min. Per lo spessore di 25 micron padrone designato, cappotto girare il photoresist negativo (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) su wafer di silicio a 2000 rpm per 30 sec. Morbido cuocere la cialda su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 95 ° C. Esporre ai raggi UV (365nm) per 250mJ/cm 2 a un film maschera (CAD / Servizi Arte, Bandon, OR) contenente la progettazione di microcanali. Post-esposizione cuocere la cialda su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 95 ° C. Sviluppare il wafer utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist. Il wafer fantasia è duro cotta su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 200 ° C. Mantenere il wafer a 200 ° C per almeno 5 ore, poi gradualmente raffreddare la cialda a temperatura ambiente. Importante: rampa graduale durante il SU-8 processo di cottura master è necessario, altrimenti il SU-8, la struttura può staccato dal wafer di silicio o crepe sulla struttura di SU-8 può essere indotta da stress-release. E. Stampaggio Replica del PDMS dai maestri e l'adesione al vetro di copertura Il SU-8 master è posto in una barca di pesatura. Mix di silicone elastomero e catalizzatore (Poly (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in un 10: 1 rapporto. Versare il composto PDMS sul SU-8 master e lasciare la barca pesa in un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle. Curare il PDMS a 65 ° C per 1-2 ore. Sbucciare la striscia PDMS dallo stampo maestro Si. Punch insenature canale e uscite del dispositivo fluidica. Pulire la striscia di PDMS e vetro di copertura con etanolo e poi asciugare all'aria. Trattare la pulizia PDMS striscia di vetro e coprire con plasma di ossigeno (20 W per 1 minuto). Immediatamente la striscia PDMS legame con il vetro di copertura. Lascia il chip incollato microfluidica in forno a 95 ° C per una notte. Importante: il trattamento al plasma e da forno durante la notte sono essenziali per la forza di legame maggiore. F. Monitorare la formazione di DNA Nanocomplexes Nel dispositivo a microfluidi Riempire il canale microfluidica con acqua (per assicurarsi che ci sia assenza di bolle all'interno del canale microfluidica), prima di caricare i reagenti per assicurare un flusso regolare durante l'esperimento. Caricare il DNA QD-etichettati e marcati con Cy5 soluzioni di chitosano in due siringhe di vetro singolo, attraverso il tubo descritto nel video. Collegare il tubo con le due insenature di dispositivi microfluidici. Essere cauti a non introdurre aria durante il processo. Impostare la velocità di flusso a 20nL/min (PHD-2000 pompa a siringa, Holliston, MA), in condizioni di flusso laminare. Controllare la microcanali sotto il microscopio. Quando il flusso è stabile (~ 15 a 20 minuti), QD-mediata FRET devono essere osservate al centro del canale. Scatta foto di fluorescenza (CCD raffreddata, Qimaging, BC, Canada) in luoghi diversi lungo il canale. Analizzare le immagini a fluorescenza con ImageJ e OriginLab. Figura 1. QD-FRET fornisce un'indicazione sensibile l'insorgenza di Nanocomplexes DNA auto-assemblaggio Quantum dot-mediato trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (QD-FRET) in grado di fornire una indicazione quantitativa e altamente sensibile di stabilità Polyplex sia in ambienti extra o intra-cellulari, permettendo per la rilevazione inequivocabile l'inizio delle interazioni tra il DNA e il vettore genico. Il FRET coppia, 605QD e Cy5, è stato scelto sulla base di massimizzare sovrapposizione spettrale tra il donatore e accettore e riducendo al minimo il potenziale cross-talk. Per questa coppia, la distanza di Förster è 69.4Å 3. Auto-assemblaggio del QD-FRET nanocomplexes DNA. Anionici DNA plasmidico (PDNA) e il vettore gene cationici sono stati etichettati con QD (donatore di energia) e Cy5 (energia accettore), rispettivamente. QD-FRET nanocomplexes si sono formati attraverso elettrostatiche coacervazione complessi. Al momento di eccitazione a 488 nm, QD-FRET-mediata Cy5 emissione indicati formazione di un nanocomplex compatta e intatta. Il tempo di permanenza (t R) può essere calcolato in base alla distanza (x) che misura, da dove i due flussi si incontrano per la posizione di reazione sotto inchiesta, e la velocità di flusso medio (v). A causa della natura del flusso laminare, la miscelazione avviene esclusivamente a livello di interfaccia (centro di ogni immagine), che consente il calcolo preciso di trasporto di massa in funzione di t R. Risoluzione temporale può essere regolata variando la applied portate. (Interno) FRET-mediata segnale è stato osservato immediatamente a livello di interfaccia, quando i due corsi d'acqua ha incontrato, a indicare che il legame è stato rapido, che si verificano in pochi millisecondi in base ai tassi di flusso applicati. Scala Bar: 100μm.