Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

Summary

Vi beskriver en process med laser capture microdissection att isolera och extrahera RNA från en homogen cellpopulation, pyramidala nervceller i lager III i superior temporal gyrus i döden mänskliga hjärnor. Vi därefter linjärt förstärker (T7-baserat) mRNA, och hybridisera provet till Affymetrix mänskliga X3P microarray.

Abstract

Vi föreslog att undersöka den grå massan minskning av superior temporal gyrus ses i schizofrenipatienter, genom att förhöra genuttrycksprofilerna av pyramidformade nervceller i skikt III. Det är väl känt att hjärnbarken är en ovanligt heterogen struktur med olika regioner, lager och celltyper, som alla kännetecknas av distinkt cellulära och molekylära sammansättningar och därför differential gen profiler uttryck. Kringgå förbryllande effekter av vävnad heterogenitet använde vi laser capture microdissection (LCM) i syfte att isolera våra specifika cell-typ, dvs pyramidala nervceller.

Cirka 500 pyramidala nervceller färgats med Histogene färglösningen fångades med hjälp av Arcturus XT LCM-system. RNA var då isolerat från fångas celler och genomgick två omgångar av T7-baserade linjär förstärkning med Arcturus / Molecular Devices kit. Den Experion LabChip (Bio-Rad) gel och electropherogram visade god kvalitet ett (m) RNA, med en avskrift längd sträcker sig förbi 600nt krävs för mikroarrayer. Mängden erhållna mRNA genomsnitt 51μg med godtagbart genomsnittligt urval renhet som anges av A260/280 förhållandet, på 2,5. Gene expression var profilerade med mänskliga X3P GeneChip sond samling från Affymetrix.

Protocol

1) Tissue sektionering: Vi fick de nödvändiga vävnaden (kontroll n = 9, schizofreni n = 9) från Harvard hjärnvävnad Resource Center, matchade för ålder, kön och obduktion intervall (PMI) (tabell 1). Flytande kväve ånga block var ca 3 mm tjock togs från Brodmann s område 42 (superior temporal gyrus). Innan färgning av pyramidal nervceller, förutsättningar måste optimeras för att uppnå optimal vävnad "lyft" och hög RNA kvalitet. Tissue "lyfta" beskriver processen under laser-capture microdissection, där nervceller märkta för att fånga ansluta sig till den gemensamma jordbrukspolitiken och separeras medan resterande vävnad kvar. Optimering: För att minska RNase verksamhet, som kompromisser RNA kvalitet, behandla alla ytor, inklusive arbetsområdet, sektionering blad och diabilder med en RNase sanering lösning, exempelvis RNas Zap, förutom att torka ner med 100% etanol. § vävnaden med kryostat inställd på -17 ° C. Detta minskar temperaturgradienten mellan rumstemperatur (diabilder), den kryostat och torris (se hela processen nedan). Om temperaturen är under -20 ° C, vävnadssnitt tenderar att strimla, gör dem obrukbara. Högre och temperaturen ökar gradienten, vilket kan äventyra RNA integritet. Sektionerna bör 8μm tjock som tjockare delar i slutändan kommer att kompromissa vävnad "lyft". Denna tjocklek möjliggör också korrekt identifiering av pyramidal nervceller för att fånga. Använd vanligt oladdat glas diabilder (t.ex. Histogene LCM diabilder) eftersom dessa inte stör vävnaden "lyfta" under laser-capture-processen. Membran bilder kan också användas, men dessa är mer lämpade att isolera stora vävnader, som membranet tenderar att lyfta något under laser-capture-processen, vilket ökar den infraröda (IR) storlek laserpunkt och minskar cell specificitet. Montera två sektioner per glasskiva, som mer än två sektioner per bild kan äventyra RNA kvalitet på grund av den ständiga variationer i temperatur under snittning processen. Efter snittning, placera objektglasen omedelbart till en mikro bild ruta på torris för att bevara RNA integritet. Skjut lådor som innehåller hjärnan sektionerna därefter förvaras vid -80 ° C tills bearbetas. Vi har tidigare fastställt att för pyramidal nervceller, 500 celler per ärende är tillräckliga för att skaffa tillräckligt RNA för microarray-hybridisering. Cirka fyra sektioner behövs per ärende, främst på grund av snittning och färgning artefakter. 2) Infärgning av pyramidal nervceller: Identifiering av pyramidala nervceller uppnås med Histogene snabba färglösningen och kit, eftersom det tillåter oss att visualisera dessa nervceller, utan att långvarig exponering för vattenlösningar, och därigenom bevara RNA. Förbered för färgningsproceduren genom att lägga 1μl RNas hämmare per 100μl av färglösningen (t.ex. Promega) för att begränsa RNas aktivitet. Fyra sektioner (2 bilder), kräver 4μl av RNase inhibitor tillsättas 400μl av Histogene färglösningen i en 1,5 ml mikrocentrifugrör (förvaras på is). För varje avsnitt använder vi 97μl av denna lösning, vilket ger oss en lämplig färg för att identifiera pyramidala nervceller. Förbered uttorkning serier och xylen: delprov 25ml av lämpliga prover av i färgning burkar som medföljer Histogene kit, dvs 2×75%, 95%, 100% och 2 burkar av RNase-fritt vatten. Placera alla burkar i en ishink, förutom en 75% burk, som du placerar i -20 ° C frys. I ett dragskåp, lägg molekylära filter i Xylen burken för att avlägsna överflödigt vatten, vilket kan äventyra vävnad "lyft". Slå på vattenbad (eller värmeblock) med temperaturen inställd på 42 ° C och placera en 50 ml Falcon rör stöds av ett ställ i vattenbad. Ta två bilder från -80 ° C och tina dem på ett KimWipe i cirka 30 sekunder, eller bara tills hörnen på bilderna börjar att tina. Kortfattat fixa bilderna i 75% etanol i 30 sekunder i -20 ° C frys. Överför bilder mellan färgningen burkar med RNase-zapped pincett för att minska föroreningen. Efter en 30 sekunder tvätta i nukleasfritt vatten kan profiler beskrivs med en PAP barriär penna för att koncentrera lösningen avsnittet, dock med slätten glasskiva detta inte är absolut nödvändigt. Fläck de fyra sektioner med Histogene färglösningen i 20 sekunder, med 97μl av fläcken / RNas hämmare per avsnitt. Därefter torkar de avsnitt i den tidigare beredda prover av på is, till 30 sekunder per steg. Den sista 100% etanol steg bör utvidgas till 3 minuterFör att uppnå tillräcklig uttorkning för adekvat tissue "lyft" och fånga på LCM mössor. Sänk ned objektglasen i xylen i 5 minuter och lufttorka i dragskåp-huva i ytterligare 5 minuter före fånga. Den färgning steg bör endast utföras om laser-fånga omedelbart därefter. Alla lösningar skall bytas var 4-6 diabilder för att förhindra föroreningar och för att säkerställa korrekt uttorkning. 3) Enstaka cell laser-capture microdissection: Efter färgning är pyramidala nervceller från skikt III bort med laser capture microdissection med Arcturus XT system och programvara. I korthet fungerar systemet med pulserande en justerbar styrka IR-laser genom en termoplastisk film ligger vid foten av en mössa, vilket resulterar i en utvidgning / buk av filmen direkt på cellerna av intresse. När locket lyfts från vävnaderna, cellerna förblir fångade / fångenskap på locket. En illustrerad sammanfattning ges i figur 1. Innan du startar denna procedur, är det viktigt att skilja mellan de två typerna av mössor finns med detta system. Medan Macro CapSure cap används vanligen för att fånga större vävnader strukturer, är CapSure HS caps för att fånga ett litet antal enskilda celler och därför dessa tak har en mindre yta som utsetts för att fånga. HS caps har också skenor som hindrar locket från att vara i direkt kontakt med vävnaden avsnittet, medan Makro locket inte. Dessa skenor minska effekten av vävnad vikbara som kan påverka eller framkalla variabilitet spot storlek (i laserpuls) som Makro locket sitter direkt på vikt, ojämn vävnad. För vårt förfarande har vi använt HS caps att dra nytta av deras förmåga att minska effekten av vävnad falsning, men behöll Makro cap inställningarna på mjukvara för att maximera de tagna område som vi är att fånga ett stort antal celler. Ladda diabilder och mössor på Arcturus XT apparaten. Använd CapSure HS mössor, men behåll programmet inställningen på makro. Klicka på rutan "Load med översikt" för att få en överblick foto av varje bild. Justera ljusstyrkan / fokus på 2x förstoring, för att avgöra vilken del skulle vara optimalt för laser-capture. Undvik vävnadssnitt med överdriven vikning, utan snarare välja avsnitt som är intakta, slät, och fläckade väl, speciellt nära regionen av intresse, dvs skikt III. Vi lägger sedan ett lock över det allmänna område där vi kommer att fånga och se till att inkludera lager III. Fortfarande på 2x förstoring, se till att locket inte rälsen vilar på någon veck, eftersom detta kommer att luta locket. Därefter bekräftar vi placeringen av IR laserpunkt manuellt vid 40x förstoring. Om fläcken (röd stråle) inte korrelerar med den blå korset, kan detta justeras genom att högerklicka på plats och välja "ligger IR-spot". Vid 40x, kan vi börja att identifiera pyramidala nervceller i enlighet med följande kriterier (1) celler som pyramidformade i form och (2) den proximala delen av apikala och / eller basala dendriter kan identifieras (Figur 1A). Vi justerar nu kraften och varaktigheten av laserpulsen för att fånga den pyramidala neuron. Detta är särskilt viktigt eftersom det avgör det specifika i cellen fångas utöver antalet fångade celler. Om pulsen är för svagt inte alla identifierade nervceller kommer att fångas in, medan om pulsen är för stark kan det ta omgivande vävnad / celler än neuron ensam. Generellt med vävnader och celler specifikationer anställd här, laser styrka (70mW) och varaktighet (16msec) resultera i en plats storlek på 25μm, ungefär i linje med pyramidala neuron storlek (Fig. 1B). Men dessa inställningar finjusteras till varje avsnitt för att få ungefär samma strålpunkt per ärende. Om "lyfta" äventyras, kan man öka alltid antalet fångade celler för att hålla mängden RNA från varje fall jämförbara. Men se till att hålla din fånga tid, inklusive färgning under 1,5 timmar, längre än så kan kompromissa RNA kvalitet. Först sparar positionen för den gemensamma jordbrukspolitiken genom att klicka på plustecknet vid den position som funktion. Detta sätt, om vi av någon anledning måste ta bort locket och sedan måste lägga tillbaka på samma plats, kommer att locket alltid återgå till exakt samma ställe som du justerat platsen storlek. Skriv in dessa värden i kontrollen rutan: 70 till makten och 16 i längd. Avmarkerar "auto flytta scenen" alternativ, och se till att rätt storlek symbolen korrelerar med symbolen på panelen till höger. Markera cirkeln alternativ (längst ner till höger) för att välja en neuron som du vill testa fånga, och sedan aktivera lasern genom att klickapå "test IR-spot". Platsen som gjorts av lasern bör först och främst ha en skarp mörk ring runt objektet fångas. Om den här ringen är för ljus, var cellen inte fångas. Om det finns en mörk fläck mitt i den mörka ringen, sedan laser styrka / längd är för stor, och det kan ha en negativ effekt på RNA som finns i den tagna cellen. Se till att ringen är stor nog att omfatta cellen, men så liten att den inte innehåller oönskad vävnad eller andra celler. Upprepa processen på olika delar av vävnaden i det lager som du vill fånga, för att kontrollera att strålpunkt inte skiljer sig beroende på platsen. Justera därefter. När laserpunkt har justerats, fortsätta att identifiera pyramidala nervceller för att fånga. Vi identifierar ungefär 500 celler per prov, vilket resulterar i cirka 500pg av totala RNA per prov. Vi brukar bara använda en del för att minska mängden fånga tid, eftersom locket måste justeras för varje avsnitt. När du har identifierat alla de celler som du behöver, trycker på laser-capture-knappen och alla dina celler kommer automatiskt att fångas upp på locket (bild 1C). När alla celler har fångat, flytta locket till en annan del av bilden som inte innehåller ett avsnitt. Gå tillbaka till där cellerna tillfångatogs och se till att minst 90% av nervceller togs bort. Om inte, försök inte att återta samma celler, men hitta det område där de flesta celler fångades, och fånga fler celler i samma område. Flytta locket till QC stationen. Placera locket i 0,5 ml mikrocentrifugrör från Applied Biosystems (kat. # N8010611) som innehåller 50 ml extraktionsbuffert (PicoPure RNA Isolation Kit). Den gemensamma jordbrukspolitiken har utformats för att passa perfekt in i detta specifika röret för att förhindra att buffert läcker. Vänd montering upp och ner, se till att extraktionsbuffert täcker hela locket, och placera den på botten av 50ml Falcon röret redan finns i vattenbad inställd på 42 ° C. De nervceller inkuberas i 30 minuter för att avlägsna vävnad från locket. Därefter centrifugeras röret och locket montering i 2 minuter vid 800 gram. Ta av locket och förvara resterande cellextrakt vid -80 ° C tills RNA-extraktion. Som en extra försiktighetsåtgärd kan du se över taket på QC stationen på laser-fånga apparater att säkerställa att alla nervceller har tagits bort från locket själv. 4) Att få RNA från specifika neuronala populationer: Man kan gå direkt från att fånga till isolering, eller tina provet förvaras i -80 ° C frys. I vårt experiment samlade vi först alla de prover som krävs och lagras dem vid -80 ° C innan du fortsätter till RNA isolering. RNA-isolering utförs med hjälp av PicoPure Isolation Kit, som är utformad för att isolera ett litet antal celler från LCM prover och att behålla låga överflöd mRNA. Generellt följer vi de protokoll som ingår i satsen. Nedan ger vi en grundläggande beskrivning av processen. Efter upptining, lägg till 70% etanol (medföljer kitet) och centrifugera på konditionerade rening kolumn i syfte att binda RNA till kolumnen filtret. Efter tvättning, behandla RNA med DNas i syfte att säkerställa fullständig borttagning av DNA för att eliminera risken för DNA-störningar. Detta steg är särskilt viktigt i efterföljande program som i realtid QRT-PCR. Efter DNA smälta, det finns en annan tvätta steg. Kontrollera att inga tvättbuffert kvar i kolumnen innan de överförs till en annan mikrocentrifugrör, som någon närvaro av bufferten i din slutliga urvalet kommer att resultera i färre start RNA för förstärkning. För att säkerställa detta, centrifugera vi den sista tvätten steget för 2,5 minuter i stället för 2 minuter som föreslås i det medföljande protokollet. Slutligen är eluering buffert läggas och inkuberas på filtret i kolumnen under 1 minut följt av centrifugering, för att eluera totala RNA. Pipettera 1.3ul av varje prov i separata 0,5 ml rör för att driva en Experion HighSens LabChip. Frys resten av provet vid -80 ° C. Kvalitetskontroll är mycket viktigt när isolera RNA, speciellt när mängden är liten och det belopp som behövs, exempelvis för microarray experiment (15μg), är stor. Den extraherade RNA därför måste genomgå kvalitetskontroll vid olika tidpunkter under hela processen. Den första sker efter extraktion. Vi fastställa totala RNA integriteten genom grov granskning av 18S/28S toppar electropherograms och virtuella gel som genereras av Experion HighSens LabChip. Denna metod är snabb och ger två mätningar för att kontrollera RNA kvalitet-en electropherogram och en virtuell gel (Fig. 2). Om kvaliteten av den totala RNA är relativt god (Fig.. 2A, B mot C, D), fortsätter vi sedan med linjärt förstärka mRNA, som står för cirka 2% av den totala RNA. 5) Linjär förstärkning: Förstärkning av RNA ur laser fångade-vävnader är nödvändig för att producera en tillräcklig mängd RNA för efterföljande microarray hybridisering och QRT-PCR experiment. För att minimera risken för potentiella förvirrar noterade med T7-baserade linjär förstärkning, minimerade vi antalet omgångar av förstärkning behövs genom att öka mängden av utgångspunkterna laser fångade-vävnad material. Våra preliminära data (visas inte) tyder på att två omgångar av linjär förstärkning (RiboAmp HS PLUS-kit) av den totala RNA extraheras från vävnader som innehåller ungefär 500 celler skulle producera cirka 50 mikrogram av ARNA – tillräckligt för att utföra både mikroarray och QRT-PCR experiment. Om möjligt, undvika onödig överföring av prov mellan 0.2ml och 0.5ml rör med 0,5 ml block i värmecykeln och 0.5ml rör anges i satsen. Återigen är det protokoll som följde en som följer med kitet. En förkortad version beskrivs här. Tillsätt 1μl av primer som till den totala RNA-prov (ca 11μl) och inkubera vid 65 ° C i 5 minuter, följt av kyla vid 4 ° C under 1 minut. Lägg första delen cDNA komponenter tillsammans med Upphöjd III omvänt transkriptas och inkubera vid 42 ° C i 1 timme. Efter andra delen cDNA syntes, rena den resulterande cDNA med hjälp av en förutsättning rening kolumn. Här rekommenderar vi att vid överföring av provet plus bindningsbuffert till rening kolumnen att centrifugera provrören två gånger – en gång efter att överföra provet till kolonnen, som upp till 1μl prov kvar på sidorna av rören efter överföringen. Tvätta cDNA med den medföljande tvätta buffertar och eluera det renade cDNA med eluering buffert. Lägg in vitro transkription komponenter och inkubera i 6 timmar vid 42 ° C. Efter en DNas steg, rena den resulterande ARNA med den medföljande buffertar, så småningom eluerande det i ett totalt 12μl av eluering buffert. RNA genomgår ytterligare en runda av linjär förstärkning (med separat grundfärger – se kit-protokollet), varefter mer kvalitetskontroll steg är anställda. Ett ul av provet späds ut till ca 250ng/ul att bestämma längden mRNA utskrift och koncentration med StdSens LabChip (Experion). Traditionella Affymetrix microarray-tekniken kräver att mRNA vara minst 600 nukleotider i längd för att kunna upptäckas. Gelen och electropherogram erhålls från LabChip bör därför skildra denna minimilängd mRNA avskrift (Fig. 3). En ytterligare kvalitetskontroll bestäms via en NanoDrop spektrofotometer analys, där ett förhållande som består av två optiska densiteter, dvs A260 och A280, avgör RNA renhet. Prover med en optisk densitet omkring 2,1 bör märkas för genuttryck analys, även om nyckeltal upp till 2,7 har visats ha jämförbara hybridisering kvalitet. Koncentrationen bör också mellan 800ng/μl-1μg/μl, som lägre än detta har lett till att RNA nedbrytning vid lagring (även vid temperaturer under -80 ° C) och har också lett till dåliga microarray resultat. 6) Biotin-märkning mRNA prover för Affymetrix microarray analys: TURBO Biotin märkning kit (slut-märkning) från Molecular Devices används för att märka ARNA från förstärks prover. En förkortad version av protokollet finns här. Justera volymen på 20 mikrogram för varje ARNA prov 13μl totalt genom att lägga nukleasfritt vatten eller genom att koncentrera provet i ett vakuum centrifug, beroende på den ursprungliga koncentrationen. Trots att endast 15μg är nödvändig för den använda Affymetrix chipet lägger vi 20μg att den första reaktionen, som vissa RNA bryts under inkubation och centrifugering. Inkubera biotin reaktionen vid 85 ° C i 30 minuter, och sedan kyla vid 4 ° C. Ta bort överflödigt biotin etiketten genom centrifugering med de specialiserade kolumnen som medföljer satsen. I vissa fall, speciellt med trasiga mRNA som det som erhålls från FFPE (formalinfixerade, paraffininbäddade) Prover, kan det vara så att inte alla mRNA elueras på den inre centrifugeringssteget. Vi då rekommenderar att du lägger mellan 1-5μl extra nukleasfritt vatten till kolumn med en efterföljande extra centrifugering steg 1 minut. Detta säkerställer att de flesta av de märkta provet elueras. Den slutliga volymen är 20μl, med en koncentration av 1μg/μl. Om extra nukleasfritt vatten lades koncentrera prover tillrätt volym med ett vakuum centrifug. Vi rekommenderar att hålla lagring koncentration innan hybridisering över 800ng/μl, som vi har funnit att mindre än detta kommer att leda till nedbrytning under lagring och / eller hybridisering leder till dåliga microarray resultat. ARNA var då hybridiseras och genuttryck profilerade, med hjälp av Human X3P GeneChip sond samling från Affymetrix. Eftersom detta chip var utformade för mer försämrad Ärna använde vi det som en försiktighetsåtgärd, eftersom många faktorer vi inte kan kontrollera kan påverka kvaliteten på döden vävnad. Eftersom vårt labb inte hade tillräckliga resurser för hybridisering, var processen utförs vid Partners Genomic Core Facility. Representativa resultat: 1 +2 +3) Tissue snittning, färgning av pyramidala nervceller och laser-capture microdissection: Protokollet som beskrivs ovan bör resultera i två bilder med fyra sektioner per bild. Varje avsnitt ska vara smidig med minimala bristningar, sprickor och vikning. Med rätt färgning kommer fläcken identifiera mörkt färgade pyramidala nervceller runt 20 – 25μm i storlek med en pyramidal form och synliga apikala dendriter. Med CapSure HS caps på makro-inställningar och korrekt inställning av lasern kraft och styrka för varje avsnitt, bör du få runt 500 till 700 celler per avsnitt / fall som lett till minst 500pg av totala RNA. Cirka 85 – 100% av nervceller kommer att följa den gemensamma jordbrukspolitiken (bild 1). 4) Att få RNA från specifika neuronala populationer: Som beskrivits, efter total RNA isolering, kontrollerar vi RNA kvalitet genom en electropherogram och virtuella gel via Bio-Rad Experion. I electropherogram bör du se två olika toppar som motsvarar de 18S och 28S ribosomalt RNA enheter. Med döden vävnad, är detta dock inte alltid fallet, eftersom vävnad kan brytas ned till följd av faktorer före snittning. Du ser normalt en stor bula som visar förnedring, med en stor topp runt 18 år, och en mindre 28S topp (Fig. 2A, B). Så länge electropherogram profilerna är jämförbara mellan olika prover, har vi funnit denna riktlinje att resultera i mRNA kvalitet bra nog för att utföra både RT-PCR och microarray-studier (Imbeaud et al., 2005). Om det är för mycket förnedring – som framgår av ett stort område under kurvan för den electropherogram, eller om topparna inte är synliga (bild 2C, D) – bör de celler fångas igen från vävnaden. Vi vill också rekommendera att göra en vävnad-skrapa test, där RNA extraheras från hela fragment av avsnittet (inte bara celler), innan återta cellerna för att avgöra om vävnaden blocket i sig är förstörd. 5) Linjär förstärkning: För att testa kvaliteten på mRNA efter två rundor av linjär förstärkning, gjorde vi använder för både Bio-Rad Experion StdSens LabChip och NanoDrop spektrofotometer. Traditionella Affymetrix microarray-tekniken kräver att mRNA vara minst 600 nukleotider i längd för att bli upptäckta, som erhölls med detta protokoll. I själva verket var mRNA längder upptäcktes i 1000-nukleotid sortiment. Den electropherogram speglar också detta med stora toppar långsamt fallande som en funktion av tiden (Fig. 3A, B). Den NanoDrop avläsningar visade en A260/A280 förhållandet genomsnitt 2,5 över prover, som visar livskraftiga mRNA (tabell 2). Våra resultat visar att med detta protokoll är både kvantitet och kvalitet av RNA fått tillräckligt bra för att förhöra skillnader genexpression via Affymetrix mänskliga X3P GeneChip. 6) Biotin-märkning mRNA prover för Affymetrix microarray analys: Efter hybridisering till Affymetrix mänskliga X3P GeneChip uppnådde vi procent samtal på i genomsnitt 26,6% (tabell 2), vilket indikerar adekvat hybridisering och intensitet sond. Tabell 1: Cohort sammandrag Prover Grupp Kön Ålder PMI C1 KONTROLL F 79 15,00 C2 KONTROLL M 22 21,47 C4 KONTROLL M 75 20,25 C5 KONTROLL M 80 15,50 C6 KONTROLL F 58 21,08 C8 KONTROLL M 61 17,00 C10 KONTROLL F 71 20,50 C11 KONTROLL F <tD> 90 12,66 C12 KONTROLL F 86 6,92 MEAN 4M/5F 69,11 16,71 S1 SCHIZOPH. F 93 6,92 S2 SCHIZOPH. M 55 21,40 S3 SCHIZOPH. F 67 21,80 S4 SCHIZOPH. F 55 22,00 S5 SCHIZOPH. M 36 17,97 S6 SCHIZOPH. M 62 10,75 S8 SCHIZOPH. F 92 17,80 S11 SCHIZOPH. M 56 21,83 S12 SCHIZOPH. F 88 13,33 MEAN 4M/5F 68,11 16,90 Förkortningar: F – kvinna, M – Man, PMI – döden intervall, schizoph. – Schizofreni. Tabell 2: Sammanfattning av resultat som visar RNA-koncentrationen, kvalitet och hybridisering effektivitet Prover [MRNA] ng / ul A260/A280 Probe Intensitet Procent ringa C1 1318,01 2,67 63 19,5 C2 2312,93 2,37 147 30,6 C4 1811,92 2,44 69 26,6 C5 1316,26 2,51 78 34,7 C6 1663,24 2,39 66 33,8 C8 633,05 2,54 101 15,2 C10 1326,4 2,47 92 32,5 C11 994,24 2,75 76 22,4 C12 817,23 2,7 56 15,2 S1 2560,88 2,47 78 25,0 S2 2169,61 2,43 76 26,5 S3 2067,32 2,52 87 22,1 S4 1563,89 2,75 82 28,1 S5 2071,44 2,44 88 28,2 S6 2532,59 2,34 72 30,7 S8 2189,22 2,5 62 31,8 S11 1669,89 2,47 41 27,3 S12 1739,35 2,47 42 28,0 MEAN 1708,75 2,51 76,44 26,57 Figur 1:. Sammanfattning av laser capture microdissection process A) Pyramiddiskussion nervceller identifieras morfologiskt. B) Efter lasern har pulsade genom termoplastisk film, cellerna följa de lock och är därför inte längre i bilden och lämnar omgivande vävnad bakom. C) Photomicrograph av en homogen cellpopulation fastnat på CapSure locket efter laser fånga. Figur 2:. Total RNA kvalitetskontroll A + B) ger god kvalitet totala RNA efter isolering, medan C + D) illustrerar vad totala RNA inte ska se ut efter isolering. A) En electropherogram med klara 18/28S toppar som motsvarar den virtuella gel i (B). C) En electropherogram visar ett stort område under kurvan och ingen 18S/28S toppar tyder RNA nedbrytning. Detta framgår också i den virtuella gel (D). Figur 3:. MRNA kvalitetskontroll A + B) Electropherogram (A) och virtuell gel (B) anger mRNA-transkriptet Length (spridning) nödvändiga för microarray studier, utvidga det vill säga senaste 600 nukleotider (NT). C + D) Electropherogram (C) och virtuella gel (D) visar vad en otillräcklig mRNA spred skulle se ut, eftersom mRNA-transkriptet längden inte sträcker sig förbi 200nt.

Discussion

Här försöker vi att skräddarsy ett protokoll för att extrahera homogena cellpopulationer från heterogena obduktion hjärnvävnad med hjälp av Arcturus XT-systemet och relaterade RNA-kit extraktion. Som beskrivits ovan har vi gjort en del ändringar i de ursprungliga protokollen från företaget, för att maximera RNA integritet. Den framgångsrika upptagningen av enskilda celler beror enbart på att optimera de steg före att fånga för att uppnå maximal celler med gott RNA. Dessa åtgärder inkluderar de olika parametrarna i samband med vävnaden snittning och färgning. Kort sagt, när det gäller vävnad förberedelse dessa inkluderar: 1) minskar temperaturgradienten vid snittning, 2) bara placera två sektioner per bild, 3) kan utföra alla uttorkning steg på is, 4) att lägga RNas Inhibitor till fläcken, 5) ökar av uttorkning varaktighet i den slutliga 100% etanol till 3 minuter.

När det gäller att fånga upp, känner vi att kombinationen av CapSure HS mössor, med programvaran på Macro inställningen bör för bästa resultat. En fukt-kontrollerad miljö är avgörande för att fånga enskilda celler, som hög luftfuktighet drastiskt minskar vävnad "lyft". Höga temperaturer kan också ha en negativ effekt på RNA kvalitet.

Under RNA isolering protokollet med PicoPure kit, det finns två tvättar steg. Det är viktigt att kontrollera att alla tvättbuffert tas bort innan de överförs till en annan mikrocentrifugrör för RNA eluering, som någon närvaro av bufferten i din slutliga urvalet kommer att resultera i färre start RNA för förstärkning. För att säkerställa detta, centrifugera vi den sista tvätten steget för 2,5 minuter i stället för 2 minuter som föreslås i det medföljande protokollet.

För det mesta var linjär förstärkning protokollet enligt tillverkarens anvisningar. Bör dock två viktiga punkter bör beaktas vid användning av detta protokoll: 1) Försök att begränsa förlusten av RNA via överskott överföring av prover mellan rören genom att använda enbart 0,5 ml rören lämnas i samband med ett 0,5 ml block i termocykeln och 2) när du överför provet till rening kolumnen för rening av cDNA, se till att spinna ner i provrören efter den första överföringen. Detta kommer att resultera i ytterligare en 1-2ul av provet för att lägga till rening kolumnen och därför kan öka cDNA återhämtning.

Vid användning av TURBO end-märkning kit för biotin-märkning av din begränsade ARNA prover, föreslår vi att lägga till en extra några l s vatten innan centrifugering steg för att öka de märkta RNA avkastningen ur kolonnen. En extra minut av centrifugering kommer också att bidra i detta avseende, särskilt om du arbetar med trasiga vävnad, såsom FFPE vävnad.

Vi är övertygade att detta protokoll gör det möjligt för användaren att isolera små homogena strukturer, såsom enda cell populationer inom heterogena obduktion hjärnvävnad. Detta minskar utspädningseffekter av omgivande strukturer och andra cell-typer som finns i de olika lagren i hjärnan, vilket leder till resultat riktade mot specifika celltyper under utredning. Eftersom kvaliteten på den resulterande RNA är bra nog för microarray studier, kan vi börja sätta fingret på specifika molekylära signaturer av specifika cellpopulationer påverkas sjukdomstillstånd.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
4.5” Forceps		VWR	82027-392
Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System		MDS Analytical Technologies	13821-00
CapSure™ HS LCM Caps		MDS Analytical Technologies	LCM 0214
CapSure® Macro LCM Caps		MDS Analytical Technologies	LCM 0211
Experion™ Automated Electrophoresis Station		Bio-Rad	700-7001
Experion™ RNA HighSens Chips		Bio-Rad	700-7155	10 chips
Experion™ RNA HighSens Reagents		Bio-Rad	700-7156	10 chips
Experion™ RNA StdSens Chips		Bio-Rad	700-7153	10 chips
Experion™ RNA StdSens Reagents		Bio-Rad	700-7154	10 chips
Falcon® polypropylene Conical tube		Becton-Dickinson Labware	352070
GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap		Applied Biosystems	N8010611
GeneChip® Human X3P array		Affymetrix	900516	6 chips
Histogene® LCM Frozen Section Staining kit		MDS Analytical Technologies	KIT0401	For staining solution, jars, ethanols and Xylene
Histogene™ LCM slides		MDS Analytical Technologies	12231-00
Micro Slide Box		VWR	48444-004
Microm HM 505E cryostat		Thermo Scientific	22-050-350	Catalogue number for similar product as current product no longer available
Microprocessor Controlled 280 series Water bath		Thermo Electron Corporation	51221048	Model 282
Molecular Sieve		EMD™	MX1583L-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer		Thermo Scientific	n/a	The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.
Nuclease-free water		Ambion®	AM9932
PEN Membrane glass slides		MDS Analytical Technologies	LCM 0522
PicoPure® RNA Isolation kit		MDS Analytical Technologies	KIT0204
RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling		MDS Analytical Technologies	KIT0511B	12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit
RNase Zap®		Ambion®	AM9780/2
RNase-Free DNase Set		Qiagen	79254
RNasin® Plus		Promega	N261B
SuperScript™ III Reverse Transcriptase		Invitrogen	18080-044