En In vitro FluoroBlok tumör Invasion analys

Summary

Denna video visar hur man kan mäta cell invasion genom insatser cellodling med hjälp av en fluorescens-baserad metod.

Abstract

Det kännetecknande för metastaserande celler är deras förmåga att invadera igenom basalmembranet och migrera till andra delar av kroppen. Cellerna måste kunna både utsöndra proteaser som bryter ner basalmembranet samt migrera för att vara invasiva. BD BioCoat tumör Invasion System ger celler med villkor som möjliggör bedömning av deras invasiva egendom<em> In vitro</em^1,2. Den består av en BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt tavla med ett 8,0 micron porstorlek PET-membran som har varit jämnt belagda med BD Matrigel Matrix. Denna enhetliga lager av BD Matrigel Matrix fungerar som en rekonstruerad basalmembran<em> In vitro</em> Ger en sann hinder för icke-invasiva celler medan presenterar en lämplig proteinstruktur att studera invasion. Beläggningen processen occludes porerna i membranet, blockera icke-invasiva celler från vandrar genom membranet. Däremot invasiva celler kan lösgöra sig från och vandrar genom den belagda membranet. Kvantifiering av cell invasion kan uppnås genom att antingen före eller efter-cells invasionen märkning med en fluorescerande färg som DiIC₁₂ (3) eller kalcein AM respektive och mäta fluorescens invaderande celler. Eftersom BD FluoroBlok membranet effektivt blockerar passagen av ljuset från 490 till 700 nm vid> 99% effektivitet, fluorescerande-märkta celler som inte har invaderat inte upptäcks av en bottom-läsning fluorescens plattläsaren. Däremot är celler som har invaderat på undersidan av membranet inte längre skyddade från ljuskällan och detekteras med respektive plattläsaren. Denna video visar en slutpunkt analys cell invasion, med hjälp av kalcein AM för att upptäcka invaderade celler.

Protocol

Post-märkning och mätning med hjälp av BD kalcein AM fluorescerande färg Celler är märkta för kvantifiering efter att de har invaderat genom BD Matrigel Matrix och passerade genom BD FluoroBlok membranet. Som ett resultat kan endast resultatmåttsmätningen av cell invasion erhållas. Grow celler till ~ 80% sammanflödet. Förbered och återfuktar insatsen systemet. Ta bort förpackningen från -20 ° C lagring och låt den komma till rumstemperatur. Öppna folieförpackningen och lägga till 500 mikroliter varmt (37 ° C) media till det inre av insatsen brunnar. Låt plattan rehydrera i 2 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2. OBS: Det är inte nödvändigt att rehydrera obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt System som kommer att användas som en cell migration kontroll. Efter rehydrering, försiktigt bort mediet från insatsen brunnar utan att störa lagret av BD Matrigel Matrix på membranet. Systemet är nu redo att använda. Förbered cellsuspensioner av trypsinizing cell monolager och resuspending cellerna i serumfritt DMEM på 5 x 10 4 celler / ml. Anm: Om du använder en annan celltyp du behöver för att fastställa den optimala sådd densitet. Att fastställa den optimala sådd densitet för din celltyp på en porös tillväxt yta, använd en rad seedning densitet (celler / cm 2) som parentes sådd densitet som används på nonporous ytor (dvs flaskor, fat och tallrikar). Till exempel, om du för närvarande utsädet på 2,5 x 10 5 celler / cm 2, utsäde vid olika cell-halter mellan 5 x 10 4 och 5 x 10 5 celler / cm 2 för att bestämma den optimala första sådd densitet. Tillsätt 500 mikroliter cellsuspension (2,5 x 10 4 celler) till apikala kamrarna. Tillsätt 750 mikroliter av chemoattractant (5% FBS i DMEM) till envar av de basala kamrarna, med hjälp av prov portar för åtkomst. Inkubera BD BioCoat System tumör Invasion och obestruket BD Falcon FluoroBlok 24-multispot Sätt tavla i 20-22 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2 atmosfär. Efter inkubation, försiktigt bort mediet från den apikala kamrarna. Detta kan uppnås genom att ställa innehållet i en avfallsbehållare. Rör inte bottenytan av insatsen systemet. Överför in systemet i en andra 24-brunnar innehåller 500 mikroliter / brunn av 4 mikrogram / ml kalcein AM i HBSS. Inkubera 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2. Den kalcein AM Lösningen är inte bort från den nedre kammaren innan du läser fluorescens eftersom det är en nonfluorescent viktigt färgämne som omvandlas till grönt fluorescerande kalcein av cytosoliska esteraser. Fluorescens invaderade celler läses vid våglängderna 494/517 nm (Ex / Em) på en botten behandlingen fluorescerande plattläsaren. Vinsten inställning kan behöva bestämmas empiriskt, men en mittpunkt vinst bör vara ett tillräckligt utgångspunkt. En vinst inställning som är för hög kan leda till mättnad av detektorn med mycket fluorescerande provet, detta kan förhindra förvärv av meningsfulla resultat. Användning av AutoGain (om det stöds av din läsare) rekommenderas inte. Ett inverterat fluorescensmikroskop kan användas för att verifiera dina resultat, det är framförallt bra att göra detta första gången du kör denna analys. OBS: Det är av yttersta vikt att Infoga Systems läses med rätt platta kartan. För information om hur du fyller tallriken kartor se BD Teknisk Bulletin No 436 på www.bdbiosciences.com eller kontakta BD teknisk support (labware@bd.com). Rätt platta inriktning är med väl A1 i övre vänstra hörnet och BD flacon logotyp orienterade åt höger plattan sätts in i läsaren. Datareduktion Data är uttryckt i följande ekvation: Bakgrund kan dras av före beräkningen av procent cell invasion RFU = relativt fluorescerande enheter.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.