Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)
Summary
Denaturerende ureum polyacrylamidegelelektroforese wordt gebruikt voor het enkelstrengs DNA gescheiden of tot RNA tot een limiet van 500 nucleotiden. Ureum in combinatie met de hitte gedenatureerd monsters en ongestructureerde enkele strengen migreren binnen de gel matrix op basis van hun moleculair gewicht.
Abstract
Ureum PAGE of denaturering ureum polyacrylamidegelelektroforese maakt gebruik van 6-8 m ureum, waar secundaire DNA of RNA-structuren gedenatureerd en wordt gebruikt voor hun scheiding in een polyacrylamide gel matrix op basis van het molecuulgewicht. Fragmenten van 2 tot 500 basen, met een lengte verschillen zo klein als een single nucleotide, kunnen worden gescheiden met behulp van deze methode 1. De migratie van het monster is afhankelijk van de gekozen acrylamide concentratie. Een hoger percentage van polyacrylamide lost een lager molecuulgewicht fragmenten. De combinatie van ureum en temperaturen van 45-55 ° C in de gel run zorgt voor de scheiding van ongestructureerde DNA of RNA-moleculen.
In het algemeen is deze methode nodig om te analyseren of te zuiveren enkelstrengs DNA of RNA-fragmenten, zoals gesynthetiseerd of gelabelde oligonucleotiden of producten van enzymatische splitsing reacties.
In deze video artikel tonen we hoe voor te bereiden en uit te voeren de denaturering ureum polyacrylamide gels. Technische tips zijn opgenomen, in aanvulling op het oorspronkelijke protocol 1,2.
Protocol
Discussion
- De band scherpte hangt af van verschillende factoren. Het volume van het monster geladen voor een scherpe bands moet zo klein mogelijk, dat wil zeggen idealiter tussen 1-5 pl. Echter, tot en met 15 ul worden geladen die nog steeds acceptabele oplossing zorgt. Minder monstervolume resulteert in scherpere bands.
- De band kwaliteit is ook afhankelijk van de dikte van gel. Dunnere gels, zoals 0,75 mm tonen betere resultaten dan 1,5 mm dik gels.
- De vorm van banden kunnen ook worden beïnvloed tijdens het laden van gel, al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Singapore Academic Research Council (ARC) [subsidie nummer 90/07]. Wij danken radiodurans voor de steun.
References
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. , (2001).
- . . PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. , (2001).
