Summary
Haakse microprisma ingebracht in de muis neocortex maakt diepe beeldvorming van meerdere corticale lagen met een standpunt typisch gevonden in slice. One-millimeter microprisma bieden een breed veld-of-view (~ 900 um) en ruimtelijke resoluties voldoende om dendritische spines op te lossen. We demonstreren laag V neuronale beeldvorming en neocorticale vasculaire beeldvorming met behulp van microprisma.
Abstract
We presenteren een protocol voor in vivo beeldvorming van corticale weefsel met behulp van een deep-brain imaging sonde in de vorm van een microprisma. Microprisma zijn 1-mm groot en hebben een reflecterende coating op de hypotenusa tot interne reflectie van de excitatie en emissie licht mogelijk te maken. De microprisma sonde tegelijkertijd beelden meerdere corticale lagen met een perspectief meestal alleen gezien in slice preparaten. Beelden worden verzameld met een groot veld-of-view (~ 900 um). Daarnaast geven we informatie over de niet-chirurgische ingreep te overleven en de microscoop setup. Representatieve resultaten bevatten afbeeldingen van laag V piramidale neuronen van Thy-1 YFP-H muizen tonen hun apicale dendrieten zich uitstrekt door de oppervlakkige corticale laag en zich uitstrekt tot in bosjes. Resolutie was voldoende om de afbeelding dendritische spines de buurt van de soma van laag V neuronen. Een staart-veneuze injectie van fluorescente kleurstof onthult de ingewikkelde netwerk van bloedvaten in de cortex. Line-scanning van de rode bloedcellen (RBC's) die door de haarvaten onthult RBC snelheid en de flux tarieven kunnen worden verkregen. Deze roman microprisma probe is een elegant, maar krachtige nieuwe manier van visualiseren van diepe cellulaire structuren en corticale functie in vivo.
Protocol
Deel 1: microprisma Optiek en Microscoop Setup
- De microprisma die we gebruiken zijn 1-mm, rechts-angle prisma's gemaakt van BK7 glas gekocht bij de Optosigma Corporation (figuur 1). Microprisma worden afgehandeld met behulp van een tang waar mogelijk.
- De schuine zijde van de microprisma is bedekt met verbeterde zilver tot een reflectie van meer dan 97% leveren 400 tot 2000 nm. Dit zorgt voor interne reflectie van zowel de laser-excitatie licht en de uitgezonden fluorescentie.
- Microprisma worden altijd afgehandeld met behulp van een tang waar mogelijk. Handschoenen worden gedragen te allen tijde te houden het prisma schoon te maken.
- We maken gebruik van een custom-built twee-foton microscoop die kleine dieren beeldvorming. Het dier, verbonden aan de stereotactische apparaat is geplaatst op een 3-assige gemotoriseerde podium.
- De microscoop wordt aangesloten op een Windows-pc waarop scanimage software. Scanimage is beeldacquisitie software geschreven in Matlab door Pologruto et al. 1.
- Voor microprisma imaging, verzamelen we beelden met een resolutie van 1024 x 1024 of 512 x 512 pixels. Daarnaast hebben we meestal te scannen op 2 ms / lijn of 4 ms / lijn.
- Twee soorten doelstellingen worden gebruikt in de experimenten:
- Een lagere numerieke apertuur (NA) lucht doelstelling voor breed veld-of-view beeldvorming (zie tabel van de reagentia en apparatuur).
- Een hogere NA lucht doelstelling met een glas correctie halsband staat het minimaliseren sferische aberraties veroorzaakt door 0 - 2 mm van glas (zie tabel van de reagentia en apparatuur).
- Als het dier klaar is voor beeldvorming onder een lage vergroting doelstelling af te stemmen op het plein raster scan patroon van de laser met de bovenkant van de microprisma. Dit zal helpen oriënteren het beeld en maken efficiënt gebruik van het laservermogen.
- Met behulp van een hogere NA objectief met een glas correctie halsband, stelt de correctie halsband om te corrigeren voor ongeveer 1 mm van glas. Zodra een tl-beeld tijdens het experiment, kan men voorzichtig te bereiken binnen de microscoop om de correctie kraag te optimaliseren om de beeldvorming resolutie te maximaliseren.
Deel 2: Niet-overleving Animal Chirurgie en microprisma Insertion
- De gehele procedure lengte, vanaf de eerste incisie tot de voltooiing van de beeldvorming, hangt af van de doelstellingen van het experiment. Echter, de niet-overleving chirurgische ingreep en microprisma plaatsing naar verwachting ongeveer 30 nemen - 40 minuten in beslag.
- Muizen (P30-P60) worden gewogen en verdoofd juiste gebruik van een IP-injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) om een vliegtuig geschikt is voor chirurgische ingrepen.
- Gedurende het hele experiment, moet het dier worden gecontroleerd elke 15-20 minuten tot het niveau van anesthesie te beoordelen. Als het dier reageert op een stevige teen-snuifje, een aanvullende dosis van ketamine / xylazine is vereist. Typisch een aanvullende dosis is een derde van de eerste dosis en kan van tevoren worden bereid in een spuit voor onmiddellijke IP-injectie indien nodig.
- Zodra de muis is goed verdoofd, is het merendeel van de haren op het hoofd van het dier geschoren uitschakelen met behulp van een trimmer met een # 40 mes.
- Nair ® wordt toegepast op de resterende haren op het hoofd om te helpen creëren van een oppervlak vrij is van haren die in de weg van de microprisma tijdens de beeldvorming. Na 5 minuten wordt het Nair ® schoongemaakt met behulp van een wattenstaafje.
- De verdoofde dier goed is geplaatst in een muis stereotactische apparaat. Tijdens de chirurgische procedures en imaging-sessies het dier wordt gehouden op een met water gevulde verwarming pad ingesteld op 36 graden Celsius.
- Met het hoofd van het dier correct is bevestigd op zijn plaats, is een schoon incisie gemaakt met behulp van een scalpel beneden de mediale lijn van de schedel om de huid te scheiden.
- Een kleine hoeveelheid van 3% waterstof peroxide is geplaatst op een wattenstaafje en toegepast op de schedel op te ruimen membranen tussen de schedel en de huid.
- De waterstof peroxide helpt ook te onthullen bregma, een belangrijke mijlpaal in het weten waar de craniotomie uit te voeren en steek de microprisma.
- Voordat de craniotomie wordt gestart, zijn het oor bars en bijten bar goed is afgesteld om de blootgestelde schedel, zodanig dat het in principe ter hoogte van de tafel kantelen. Dit zorgt voor een beter platform voor de craniotomie. Daarnaast, dit maakt de bovenkant van het prisma loodrecht met het binnenkomende excitatie licht. Dit zal helpen minimaliseren optische aberraties terwijl de beeldvorming.
- Een kleine tandheelkundige braam (~ 0.8 mm grootte van het hoofd) is verbonden met een Dremel ® gereedschap met een flexibele extensie arm. Voor craniotomies, stellen we de snelheid op ongeveer 7.000 tot 10.000 rpm.
- De tandheelkundige braam wordt afgeroomd langs de schedelbasis uit elkaar totdat een vierkante groef is gevestigd in het bot. De zijkanten van het plein zijn ongeveer 2-3 mm in de lengte en het midden 1,5 mm staart en 1 mm lateraal van bregma.
- Voortzetting van dunner het bot tot een kleine opening wordt gemaakt door de schedel. Een paar pincetten can lift het bot flap weg van de schedel.
- De dura moet worden verwijderd voordat de microprisma kan worden ingevoegd in de cortex. Bloeden is best gecontroleerd door het bloed te laten stollen op het oppervlak gedurende enkele minuten. Daarna is het gestold bloed verwijderd met behulp van een chirurgische spons voordat u de microprisma.
- Om u te helpen te helpen de uitlijning van het prisma met de cortex, de verticale gezicht van de microprisma rij parallel aan de handgrepen van de tang.
- Met de prisma goed gehouden, is de hele microprisma ingebracht tot aan de top van het prisma is gelijk met de neocorticale oppervlak.
- Bij het correct is geplaatst, moet de microprisma blijven in de juiste positie. Het bloeden dat de resultaten minimaal is en kan worden geabsorbeerd met een kleine chirurgische spons. Zodra het prisma op zijn plaats is het dier klaar is voor de beeldvorming.
- Na een microprisma is gebruikt in een dier, kan het worden hergebruikt meerdere malen. Dit betekent echter moeten goed worden gereinigd om alle resterende biologisch materiaal te verwijderen. Dit kan worden bereikt door het dompelen van de prisma in een klein volume HCl zuur, gevolgd door een duik in methanol. De gereinigde microprisma kan vervolgens worden verpakt in lens papier tot toekomstig gebruik.
Deel 3: representatieve resultaten
Figuur 1: Beelden van de rechter hoek microprisma. Prisma's gebruikt in dit experiment zijn een millimeter, BK7 glazen prisma's met een grotere zilveren coating op de hypotenusa tot interne reflectie van de excitatie en emissie licht mogelijk te maken.
Figuur 2: Afbeelding van laag V YFP piramidale neuronen. Breed veld-of-view beeldvorming met de microprisma onthult een grote populatie van piramidaal cellichamen ~ 800 tot 900 micrometer diep uit de corticale oppervlak. Daarnaast, apicale dendrieten omhoog naar laag te breiden Ik kan ook worden opgelost. Schaalbalk = 200 micrometer.
Figuur 3: Een hogere numerieke apertuur objectief gebruikt in combinatie met de microprisma biedt ruimtelijke resolutie voldoende om dendritische stekels op de apicale dendrieten op laag V piramidale neuronen op te lossen. Schaalbalk = 10 micrometer.
Figuur 4: Een beeld verkregen met behulp van de microprisma en een staart-ader injectie van fluorescente kleurstof. Het beeld toont de verticale, groot kaliber schepen dat zich uitstrekt van diepe hersenstimulatie gebieden en kleinere haarvaten af door middel van de corticale volume vertakking. Schaalbalk = 200 micrometer.
Figuur 5: Het gebruik van een hogere numerieke apertuur doelstelling, kan het netwerk van haarvaatjes in de neocortex worden afgebeeld met meer detail. Schaalbalk = 50 pm.
Figuur 6: microprisma maakt het ook mogelijk voor het afbeelden van rode bloedcellen (RBC's) die door schepen. RBC niet absorberen de fluorescente kleurstof en dus worden gezien als donkere strepen over het schip. Door line-scanning in het vat, kan men verkrijgen metingen van RBC flux en snelheid. Schaalbalk = 10 micrometer (horizontale balk in boven-en onderste afbeelding) en 250 ms (verticale balk in het onderste afbeelding).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van een microprisma in een imaging experiment is betrekkelijk eenvoudig en biedt vele voordelen voor in vivo studies over de neocortex. Representatieve voorbeelden met behulp van deze techniek zijn foto's genomen van transgene muizen die geel fluorescerend eiwit in laag V corticale neuronen. Met behulp van microprisma ziet men een verzameling van grote piramidale cellichamen in laag V, bijna 1 mm onder het corticale oppervlak. Ook gezien zijn de apicale dendrieten, dat door alle oppervlakkige lagen verlengen voordat uiteenlopende in plukjes (figuur 2). De muizen worden gebruikt voor deze experimenten zijn transgene dieren ontworpen om YFP uiten alleen in laag V neuronen (YFP-H 2). Met behulp van deze YFP-H muizen en een hogere numerieke apertuur doelstelling met een glas correctie halsband is het ook mogelijk om het imago van de dendrieten met meer detail en op te lossen dendritische spines (figuur 3).
Men kan ook het etiket van de corticale bloedvaten met een fluorescerende kleurstof, zoals fluoresceïne-dextran met behulp van gevestigde staart-ader injectie technieken. Typisch voor volwassen muizen een 100 ul bolus injectie van fluoresceïne-dextran bij 20 mg / ml in fysiologische zoutoplossing geschikt is. De beste resultaten komen uit het injecteren van de kleurstof na de microprisma is ingebracht in de neocortex (na stap 2.16). Met behulp van deze techniek kan men zien de grotere kaliber schepen uit diepe lagen zich naar de pia-en vertakt het netwerk van microcapillaries (figuur 4) te vormen. Deze ingewikkelde netwerk van microcapillaries in de neocortex is het best gewaardeerd met behulp van een hoge numerieke apertuur doelstelling (figuur 5).
Daarnaast is het mogelijk om rode bloedcellen snelheid en de flux te meten van diepe neocorticale haarvaten door lijn scannen over de lengte van een schip (Figuur 6, rode lijn in de bovenste afbeelding). Omdat rode bloedcellen niet nemen van de fluorescente kleurstof, zullen ze verschijnen als donkere strepen. Beelden die het gevolg zijn van een line-scan een ruimtelijke dimensie in een assen en een temporele dimensie in de andere assen (Figuur 6, onderste afbeelding) hebben. Uit deze beelden, kan men de flux en de snelheid van de rode bloedcellen te berekenen door de capillaire. In het geval van figuur 6, was de RBC flux gemeten worden 36 RBC's / seconden met een snelheid van 0,45 mm / seconde. Dit is in overeenstemming met resultaten uit de literatuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door IACUC Yale University's in te stellen.
Acknowledgments
Wij danken Anthony J. Koleske, PhD voor het verstrekken van YFP muizen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| With enhanced silver reflective coating-(R77) | OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA) | 055-0010 | With enhanced silver reflective coating-(R77) |
| Fluorescein-dextran | Sigma-Aldrich | FD70 | 70 kDa |
| 0.28 NA, 4x air objective | Olympus Corporation | XLFLUOR 4x/340 | |
| 0.60 NA, 40x air objective | Olympus Corporation | LUCPLFLN | With 0-2 mm coverglass correction |
References
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).
