Explantaten van de centrale regio van de rat lens epitheel synchroon te onderscheiden wanneer gekweekt in de aanwezigheid van FGF-2. Immunofluorescentie microscopie van dergelijke culturen kan verschaft nieuwe informatie over de genexpressie en signalering afspraken verbonden aan terminale differentiatie.
De voorste oppervlak van de ooglens is bedekt met een monolaag van epitheliale cellen, die prolifereren in een ringvormige zone ten grondslag liggen aan het corpus ciliare. Volgende indeling, deze cellen migreren naar achteren, waar FGF verspreiden van het netvlies leidt hen om te differentiëren in een achterste reeks van langwerpige lens vezels cellen, die het grootste deel van de lens samen te stellen. Differentiatie van lens epitheel cellen die in de lens van vezels kan worden geïnduceerd in vitro door het kweken van explantaten van de centrale regio van de voorste epitheel in de aanwezigheid van FGF-2. Explantaten zijn bereid uit lenzen van de neonatale ratten door het verwijderen van de lens van het oog en grijpen de lenskapsel aan de achterzijde met het ontleden van een pincet. De achterste kapsel is dan voorzichtig opengereten en drukte beneden in de plastic bodem van een weefselkweek schotel. De perifere regio's van de explantatie worden verwijderd met een scalpel en het centrale gebied wordt vervolgens gekweekt in de aanwezigheid van 100ng/ml FGF-2 voor zo lang als 2-3 weken, afhankelijk van de te onderzoeken parameters. Sinds epitheliale cellen in gekweekte explantaten onderscheiden bij benadering synchroon gedurende een periode van dagen tot weken, kan het tijdsverloop van signalering en genexpressie worden bepaald met behulp van moleculaire, biochemische en farmacologische technieken. Immunofluorescentie microscopie is een krachtige aanvulling op deze methoden aangezien het aantoont de subcellulaire lokalisatie van eiwitten van belang en kan onthullen de fysiologische gevolgen van de experimentele manipulaties van signaalwegen.
De rat lens explantatie systeem is met succes gebruikt door een aantal laboratoria om terminale differentiatie van lens epitheel cellen te bestuderen om lensvezels 21,3,4,5. Wanneer ze worden blootgesteld aan FGF-2 op 100ng/ml de explantaten zal beginnen op veranderingen in de signalering binnen enkele minuten 6 laten zien, met veranderingen in morfologie en genexpressie verschijnen opeenvolgend over meerdere dagen 3,4,5. De culturen blijven haalbaar is voor 2-3 weken als zorg is genomen om besmetting te voorkomen.
De centrale explantaten beschreven in dit protocol zijn vooral handig voor het bestuderen van de volgorde van de gebeurtenissen verbonden aan differentiatie, want ze bevatten weinig of geen cellen die differentiatie markers voor de FGF-2 te drukken is toegevoegd 1,5. De cellen vervolgens synchroon differentiëren, als een cohort, die het mogelijk maakt om het tijdsverloop van de signalering en transcriptionele afspraken verbonden aan differentiatie te volgen. Het kweken van explantaten voor verschillende lengtes van de tijd geeft dus nauwkeurige temporele informatie over de reeks gebeurtenissen. Specifieke remmers kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium om relevante signaalwegen te identificeren. Explanten kan worden gebruikt om eiwitexpressie analyseren door SDS-gel elektroforese en immunoblotting of expressie van specifieke mRNA's door RT-PCR te analyseren. Eiwit levert range 20 tot 50 ug / Explantatie-en RNA-opbrengst ligt op ongeveer 200 tot 600 ng / explantatie, afhankelijk van de lengte van de cultuur periode. Wij vinden dat over het algemeen 5-6 explantaten per gerecht voldoende eiwitten of RNA te bieden voor verschillende assays. RNA van explanten kan ook gebruikt worden om cDNA voor te bereiden op het beoordelen van genexpressie door middel van microarray analyse, die kan identificeren nieuwe genen die cruciaal belang kan zijn voor differentiatie. Explanten kan ook worden getransfecteerd. Hoewel de transfectie-efficiëntie is over het algemeen laag is, is het voldoende voor het testen van reportergenen 4, 7, 8. Immunofluorescentie microscopie van de explantaten biedt een nuttige aanvulling op biochemische methoden door het bepalen van de subcellulaire locatie van eiwitten van belang. Zo, de voorbereiding en de cultuur van de rat lens explanten biedt een krachtig systeem voor het bestuderen van terminale lens differentiatie in zoogdieren, die kunnen aanvullen in vivo technieken, zoals het genereren van transgene en knock-out muizen.
De voorbereiding van lens epitheel explanten is een aangepaste versie van methoden zijn oorsprong in het laboratorium van dr. John McAvoy 9. Dit werk wordt gefinancierd door het National Eye Institute, Intramurale Research Program Z01-EY000238-22