Summary
Homme lysat plaquettaire est une riche source de facteurs de croissance et d'un supplément puissant dans la culture cellulaire. Ce protocole présente le processus de préparation d'un grand bassin de lysat plaquettaire humaine en commençant à partir du plasma riche en plaquettes, effectuant plusieurs cycles gel-dégel et d'épuiser les fragments de plaquettes.
Abstract
Facteurs de croissance dérivés des plaquettes ont été montré pour stimuler efficacement la prolifération des cellules
Protocol
1. Matériau de départ
Commencez par plasma riche en plaquettes (PRP) unités préparées par cytaphérèse ou dérivée de Buffy contre les manteaux.
2. Vérifier la stérilité
Pour vérifier la stérilité de prendre un échantillon de 20 ml de chaque unité de PRP en transférant le volume d'un sac de petite connecté (Baxter). Débranchez ce sac par soudage.
3. Gel des unités PRP
Immédiatement après la préparation, de geler les unités PRP jusqu'à au moins -20 ° C dans le sac de stockage d'origine sans autre manipulation.
4. La décongélation des unités de HPL
Lorsque les tests bactériologiques sont négatifs, le dégel des unités humaines lysat plaquettaire, maintenant appelées unités HPL à 37 ° C (bain d'eau) jusqu'à ce que les caillots de glace disparaissent. Ne pas réchauffer le HPL.
5. Regroupement des unités de HPL
Prenez au moins dix à quinze unités décongelés HPL pour un pool de lysat plaquettaire pour préparer un produit standardisé. Connectez les sacs HPL consécutivement à la poche de pooling double (MacoPharma) et transférer le HPL dans ces deux sacs. Débranchez les sacs vides HPL par soudage. Obtenez un volume final de 3 à 4 L de mise en commun lysat plaquettaire humain (pHPL) en mélangeant le contenu des deux sacs. Connectez un petit sac (Baxter) et prendre un échantillon de 20 ml pour vérifier pHPL la stérilité du produit mis en commun. Débranchez ce sac par soudage.
6. Portionnement de l'pHPL
Portion du pHPL pour obtenir la quantité appropriée pour un traitement ultérieur. Connectez petits sacs (Baxter) à la mutualisation double sac (Macopharma) et le transfert des volumes allant jusqu'à 250 ml pour les sacs de stockage de petite taille (Baxter). Débranchez les sacs remplis par soudage.
7. Re-gel des aliquotes pHPL
Augmenter le taux de fragmentation de plaquettes et de la quantité de facteurs de croissance libérés par un autre gel / dégel étape. Geler les petits sacs de pHPL portionné à nouveau au moins à -20 ° C.
8. Re-dégel et le portionnement des aliquotes pHPL
Décongelez les sacs pHPL à 37 ° C (bain d'eau). Transférer le contenu dans des fioles de 50 ml (Falcons BD) en coupant le tube du sac à l'aide de ciseaux stériles et en versant le pHPL dans les flacons. Effectuez cette étape dans un banc de flux laminaire pour éviter toute contamination bactérienne ou fongique.
9. Suppression des fragments de plaquettes
Comme des fragments de plaquettes ont tendance à s'agréger et peut induire l'allo-immunisation, les retirer du pHPL. Centrifuger les fioles pHPL donc à 4000 g (15 minutes, 4 ° C). Dans une pipette banc de flux laminaire le plasma surnageant dans des flacons de stockage définitif (Falcons BD) et jeter les boulettes de plaquettes afin d'éviter des fragments en culture cellulaire.
10. Stockage des pHPL
Gel des aliquotes de 50 ml des flacons pHPL à nouveau à moins-20 ° C et de les stocker à des fins expérimentales.
11. L'utilisation de pHPL en culture cellulaire
Initialement ajouter de l'héparine sans conservateur au milieu pour éviter la formation de gel. Dégeler une aliquote pHPL à 37 ° C et compléter le milieu de culture par addition de 8 - 10%.
Médiums
MSC-Medium:
Utiliser 500 mL d'une MEM-, ajoutez 56 ml d'décongelés pHPL (voir aussi la référence 1 pour plus de détails) et 2 UI / ml (= 224 pi de solution de stock) de l'héparine sans conservateur (évite la coagulation du milieu par l'agglutination des le fibrinogène dans le plasma) pour atteindre une concentration finale de 10% pHPL. De plus ajoutez la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100μg/mL) solution et 2mM de L-glutamine (Sigma fois).
Filtrer le support grâce à un 20-um des pores du filtre à vide de taille (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date).
ECFC-Medium:
Utilisez une bouteille (500 ml) de l'EBM, ajouter les parties aliquotes de cytokine, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de solution mère) de l'héparine sans conservateur, la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100 g / ml) de solution et 2mm de la L-glutamine au milieu de base et le filtre avec un 20 ul-pores sous vide taille du filtre (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date).
Figure 1: Préparation du plasma riche en plaquettes à partir d'un don de sang total auprès d'une banque de sang locale ou tout autre fournisseur autorisé. Après centrifugation, le sang peut être séparé en plasma, buffy coat et les globules rouges. Quatre unités de couche leuco, le groupe sanguin O et un groupe sanguin AB plasma peuvent être regroupées avant la centrifugation pour séparer le plasma riche en plaquettes. Une unité de qualité régulières du plasma riche en plaquettes d'environ 300 ml doit contenir 1x10 9 plaquettes par ml ou 3x10 11 platelets totale.
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Discussion
Dans certaines régions plasma riche en plaquettes (PRP) peuvent être obtenus à partir de buffy-coats contraire être un produit des déchets d'emballage production de globules rouges provenant de dons de sang testés (figure 1). De façon optimale, le PRP est utilisé immédiatement pour la préparation ultérieure d'pHPL, comme en plaquettes périmées concentre la disponibilité de facteurs de croissance peuvent être réduites en raison de lésions de stockage de plaquettes et de la dégradation de 20. Il est également recommandé de produire du PRP en faisant correspondre les plaquettes du sang du groupe O avec le plasma du sang du groupe AB pour éviter les influences possibles des antigènes ABH et isoagglutinins. Jusqu'à présent, les cultures cellulaires ont surtout utilisé sérum fœtal bovin (FBS) qui supporte le risque de xenoimmunization 21 et transmission d'agents pathogènes connus et inconnus. Alternatives telles que les médias sérum autologue ou sans sérum n'a pas encore réussi à remplacer FBS dans de nombreuses applications. 22 Dans les études précédentes, nous avons comparé les effets de pHPL et FBS sur l'expansion des cellules souches mésenchymateuses révélant une efficacité de pHPL dans la propagation des cellules. 7,8,23 L'expansion isolement et à grande échelle de cellules progénitrices endothéliales sous sérum animal sans conditions dans EGM-2 complété par pHPL a été montré par Reinisch et al. al. 11 et est encore présenté comme un protocole JoVE par Nicole A. Hofmann. Les protocoles pour la préparation de MSC et préparations moyennes ECFC sont décrites dans les figures 2 et 3.
L'utilisation de pHPL comme substitut puissant pour FBS représente une étape intéressante vers un animal sans sérum Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) compatible le développement de thérapies cellulaires pour des applications cliniques. 9,24
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Austrian Research Foundation (FWF, accorder N211-NAN à la DS) et l'Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG, accorder à la N200 DS). Les auteurs remercient Url Claudia pour l'assistance technique excellente et Monica Farrell pour l'édition linguistique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double bag (2 x 3.5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | originally for ascites puncture |
| 50 mL Falcon tube | Falcon BD | 2098 | |
| 50 mL Stripettes | Costar | 4501 | |
| Plasma bags (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterile tubing welder | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Welding equipment | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Water bath | |||
| Sterile scissors | |||
| Clamps | |||
| Centrifuge |
References
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