その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション(ISTH)で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 + T細胞の空間的な近接性の、及びこれらの免疫エフェクターと標的の間の量的関係を決定することが可能に感染の結果に。
それらの感染細胞のターゲットの番号と場所への相対的な数字と場所のウイルス特異的CD8 + T細胞が隙間から慢性的な永続的な感染症の範囲という結果を決定する上で非常に重要であると考えられている。ここでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞を検出するためにその場四量体(IST)染色とin situで結合した免疫エフェクター(E)ウイルス特異的CD8 + T細胞と感染のターゲット(T)の間の空間的および定量的な関係を評価するための方法を説明します。免疫防御と感染の間に戦いが行われる組織ではウイルス- RNA +細胞を検出するハイブリダイゼーション(ISH)。 T比:ISTの染色とISHの組み合わせ、簡略ISTHは、免疫エフェクター細胞とターゲット、およびEの安易な決定の位置の可視化とマッピングが可能になります。順番にこれらのパラメータは、空間的近接性、および初期の感染の転帰を予測する免疫応答のタイミングと大きさの関係を決定するために使用することができます。
ウイルスRNAは、本報告書におけるウイルス感染細胞のマーカーとして使用されているため、ハイブリダイゼーションの前にすべての試薬は、リボヌクレアーゼフリーでなければなりません。ここで説明したin situハイブリダイゼーションの手順でその場テトラマー染色での蛍光シグナルを維持するように変更されています。 in situハイブリダイゼーションによって検出されたウイルスに感染した細胞からradioautographic信号が約1セル径の深さにあるため、その場テトラマー染色のために使用される厚さのセクションでは5 – 8 -ミクロン厚の切片に改修さでなければならない。
その場四量体にし、in situハイブリダイゼーション(ISTH)の組み合わせのこの斬新な手法では、ウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染標的細胞の空間的関係の同時可視化、マッピングおよび分析を可能にするここで説明する。このメソッドは、CD8を評価するために+ T細胞をワクチンベースおよびその他の非ウイルスの病原体と宿主の相互作用に適用することができます。画像解析の手法も、その場で相互作用する任意の2つの細胞集団、例えば、の空間的な関係を研究するために適合させることができる我々は最近、サル免疫不全のヒト以外の霊長類モデルでのHIV – 1の性的感染を研究する上で重心のマッピングの手順を使用ここで説明アカゲザル6のウイルス感染
The authors have nothing to disclose.
我々は、銀粒子の画像をキャプチャするために共焦点顕微鏡を設定するのに援助のためにJ.セッジウィックに感謝、研究資源助成のためのナショナルセンター、NIHの研究助成金AI48484(ATH)、AI20048(RA)、及びAI066314(CJM)によって部分的にサポートされている。 RR00169(CNPRC、カリフォルニア大学、デイビス)。
Solutions and Reagents:
Special equipment
IST Reagents Quick Reference
PBS-H (phosphate buffered saline with heparin)
1x PBS + 10X heparin
PBS-H/ 2% NGS (normal goat serum)
PBS-H/ 2% NGS/ 0.3% Triton X-100
PBS-H/ 0.3% Triton X-100
4% LMP Agarose
GG-NPG (glycerol gelatin with n-propyl galate
4% paraformaldehyde
Urea 0.01 M