Extraction d'ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Summary

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l'ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Abstract

Le microbiome sol est un réservoir vaste et relativement inexploré de la diversité génomique et l'innovation métabolique qui est intimement associé à des éléments nutritifs et flux d'énergie dans les écosystèmes terrestres. La culture indépendante génomique environnementale, aussi connu comme métagénomique, les approches promets un accès sans précédent à cette information génétique à l'égard de la reconstruction et la voie de criblage fonctionnel à des fins thérapeutiques de grande valeur et des processus de conversion de la biomasse. Toutefois, le microbiome sol reste encore un défi largement dû à la difficulté d'obtenir un ADN de haut poids moléculaire d'une qualité suffisante pour la production d'insérer grande bibliothèque. Ici, nous introduisons un protocole pour l'extraction de haut poids moléculaire, l'ADN génomique microbienne communauté de sols et les sédiments. La qualité de l'ADN génomique isolé est idéal pour la construction de grands insertion environnementale des banques génomiques pour des applications de séquençage et de dépistage en aval.

La procédure débute par la lyse cellulaire. Les parois cellulaires et les membranes des microbes sont lysées par les deux forces mécaniques (broyage) et chimiques (β-mercaptoéthanol). L'ADN génomique est ensuite isolé en utilisant un tampon d'extraction, le chloroforme-alcool isoamylique et d'alcool isopropylique. Les tampons utilisés pour la lyse et des étapes d'extraction comprennent isothiocyanate de guanidine et le bromure de hexadécyltriméthylammonium (CTAB) pour préserver l'intégrité de l'ADN génomique de haut poids moléculaire. Selon votre application en aval, l'ADN génomique isolé peut être davantage purifiée en utilisant du chlorure de césium (CsCl) ultracentrifugation en gradient, ce qui réduit les impuretés, notamment des acides humiques. La première procédure, l'extraction, il faut environ 8 heures, à l'exclusion étape quantification de l'ADN. L'ultracentrifugation en gradient de CsCl, est un processus en deux jours. Pendant toute la procédure, l'ADN génomique devrait être traitée en douceur pour éviter le cisaillement, éviter les vortex sévère et répétitif pipetage rudes.

Protocol

Partie I: Extraction d'ADN

Procédure

1. 8 heures sont nécessaires, pour le traitement des 6 échantillons excluant la quantification de l'ADN.

Avant de commencer l'extraction, vous aurez besoin de pré-froid de mortier, un pilon et une spatule dans un congélateur à -20 ° C ou en utilisant l'azote liquide. En outre, pré-froid des tubes de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme alcool isoamylique (24:1) sur la glace. Réglez le four à hybridation à 65 ° C à préchauffer. Vérifiez solution de CTAB, s'il est cristallisé chaude à 60 ° C pour faire fondre les cristaux. Remplissez la solution de dénaturation et de tampon d'extraction en ajoutant les ingrédients dernier juste avant de commencer l'extraction (voir la recette ci-dessous). Effectuer toutes les procédures d'extraction dans une hotte.

2. Préparer le tampon de dénaturation et de tampon d'extraction.
Remarque: Afin de maximiser le rendement de l'ADN, il est essentiel de faire des tampons avec précision en suivant les instructions.

3. Placer 2 g de sol dans un mortier pré-réfrigérée.
Remarque: Le sol prélevés sur le terrain doivent être congelés sur glace sèche pour le transport et conservés à -80 ° C. Décongeler et le sol en utilisant un tamis tamis de 2 mm avant l'extraction de l'ADN. Vous pouvez augmenter le montant de départ du sol jusqu'à 10 g.

4. Ajouter 1 ml de solution dénaturante sur le sol.

5. Gel et broyer le sol en azote liquide _{2 en} utilisant un pilon jusqu'à ce que les particules du sol poudreux et chercher homogène. Répétez congélation et broyage à deux reprises.
Remarque: Conservez l'échantillon de sol gelé pendant le broyage, en utilisant suffisamment d'azote liquide pour couvrir entièrement l'échantillon de sol. Légère fondre lors du broyage est acceptable.

6. Transfert sol-chaussée d'un tube conique de 50 ml avec une spatule de pré-réfrigérée.
Note: L'échantillon de sol au sol peuvent être conservés à -80 ° C à ce point, si nécessaire.

7. Ajouter 9 ml de tampon d'extraction. Pour mélanger la solution et le sol, brièvement au vortex à basse vitesse.
Remarque: Pour s'assurer que le tampon est homogène, il chaude à 60 ° C pendant 10-15 minutes avant utilisation. Gardez le reste de tampon à 60 ° C tout au long de l'extraction. Vortex à vitesse 8 (sur une échelle où 10 est le maximum).

8. Incuber pendant 40 min à 65 ° C dans un four à hybridation. Durant l'incubation, les tubes tournent en permanence à la vitesse la plus basse, ou retourner doucement les tubes toutes les 10 min.
Remarque: Placer le tube horizontalement dans un four à hybridation pour permettre tampon contact avec le sol sur une grande surface. La solution peut sembler un peu visqueux, pendant l'incubation.

9. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C. Transférer le surnageant dans la pré-réfrigérée tube conique de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme-alcool isoamylique (24:1), rester sur la glace.
Remarque: Lorsque vous transférez surnageant, veillez à ne pas perturber la couche organique (couche inférieure). Laisser 1-2 ml de surnageant si elle est nécessaire afin de recueillir uniquement le surnageant propre. Vous pouvez voir souvent une couche beige (environ 1-3 mm d'épaisseur) sur le dessus du surnageant. Ne pas déranger cette couche lors de la collecte du surnageant. Essayez de faire glisser la pointe le long de la paroi du tube pour éviter les bris de cette couche beige. Si le surnageant est trop trouble, répéter l'extraction d'alcool isoamyle chloroforme-une fois de plus sur le surnageant. Ne pas utiliser les pipettes en plastique jetables lors du transfert de chloroforme, le chloroforme va fondre le plastique. Utiliser une pipette en verre, ou un verre graduée, ou verser directement dans le chloroforme 50 ml tubes coniques.

10. Extrait des pastilles de sol 2 fois plus;

10.1. Ajouter 5 ml d'un tampon d'extraction des granulés du sol, mélanger délicatement à l'aide une astuce ml suivie par vortex brièvement à faible vitesse.
Remarque: Agiter et mélanger le tampon avant utilisation.

10.2. Incuber à 65 ° C pendant 10 min dans le four d'hybridation. Centrifuger à 1800 x g pendant 10 min à 10 - 14 ° C.
Transférer le surnageant dans le tube à l'étape 9. Gardez le tube avec surnageant recueilli et le chloroforme-alcool isoamylique sur la glace lors de l'extraction.
Remarque: Assurez-vous d'ajouter le surnageant dans le même tube sans croix de mélange entre les échantillons.

10.3. Répétez 9.1 et 9.2 une fois de plus.

11. Utiliser une plaque tournante, très doucement le tube de roche qui contient le surnageant recueilli (14-19 ml) et de chloroforme-alcool isoamylique à 1,25 rpm pendant 10 min.
Remarque: Fermez le couvercle très serré pour empêcher les fuites. Placez une serviette en papier sur la plaque bascule avant de placer le tube de sorte que toute fuite peut être facilement détectée.

12. Centrifuger à 1800 x g pendant 20 min à 10 - 14 ° C.

13. Transfert phase aqueuse dans un nouveau tube.
Note: Ne pas déranger l'interphase entre la phase aqueuse (couche supérieure) et organisationsnique (couche inférieure) lorsque vous transférez le surnageant. Laissez environ 1,5 à 2 ml surnageant afin d'assurer la collecte de seulement surnageant propre.

14. Récupérer l'ADN en utilisant l'alcool isopropylique (étape 15.a - 21.a). Sinon, utilisez Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage (étape 15.b - 21.b) si vous vous attendez très faible quantité de biomasse dans votre échantillon, qui produira à peine visible à granulés par précipitation d'alcool isopropylique qui est difficile à récupérer.

15.a. Placer le surnageant dans un nouveau tube d'ultracentrifugation.

16.a. Ajouter l'alcool isopropylique pour le surnageant recueilli dans un rapport de volume de 0,6:1. Inverser les tubes doucement quelques fois pour mélanger.

Incuber 17.a pendant 30 min à température ambiante.

18.a. Centrifuger à 16000 x g, pendant 20 min à 20 - 25 ° C. S'assurer que le poids de tous les tubes sont équilibrés, bien avant l'étape de centrifugation.
Remarque: Repérer le sens de la force centrifuge sur le tube, de sorte que vous pouvez détecter le culot d'ADN plus facilement lorsque le rendement en ADN est faible.

19.a. Retirer l'alcool isopropylique par décantation ou aspiration sous vide. Attention à ne pas perturber le culot d'ADN.
Remarque: Retirez l'alcool isopropylique, dès que la centrifugation est terminée. Soyez très prudent pour ne pas perdre le culot d'ADN. La taille du culot d'ADN peut varier considérablement selon le type de sol, de façon visible clairement (diamètre ~ 9 mm) pour à peine visible. Il est recommandé d'enlever les résidus d'alcool isopropylique par aspiration le long de la paroi du tube soigneusement afin de ne pas aspirer le culot d'ADN.

20.a. Dry culot d'ADN à température ambiante pendant 5 - 20 min.
Note: Ne pas trop sèche culot d'ADN, sinon il sera difficile à redissoudre l'ADN.

21.a. Reprendre le culot d'ADN dans 200 ul de TE. Il Mélanger en tapotant doucement. Transférer la solution d'ADN en tube de 1,5 ml. Garder le tube à 4 ° C pendant la nuit, afin de dissoudre complètement l'ADN.
Remarque: Selon la taille des granulés, vous pouvez régler le volume de TE à ajouter. Habituellement de 200 à 400 ul de TE fonctionne bien.

* Ou suivez les étapes 15.b - 21.b.

15.b. Pré-lavage Amicon ® Ultra-Centrifuge 15 dispositifs de filtrage, ajouter 15 ml de TE à l'appareil et centrifuger à 3500 x g pendant 10 min. Jeter l'effluent à travers.

16.b. Placer la solution d'ADN de l'étape 13 au filtre Amicon pré-lavés. Centrifuger à 3500 x g jusqu'à ce que le volume ADN est réduite à 200 - 500 pi. Jeter l'effluent à travers.

17.b. Laver l'ADN avec TE deux fois; ajouter 10 ml de TE aux dispositifs Amicon filtre. Centrifuger à 3500 x g jusqu'à ce que le volume ADN est réduite à environ 200 pi. Jeter l'effluent à travers. Répéter une fois de plus.

18.B. Transférer la solution d'ADN sur le filtre à un nouveau tube de 1,5 ml.

19.b. Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon. Lavez les deux côtés de membranes de filtration par aspiration et refoulement, afin de récupérer tout résidu d'ADN sur le filtre. Ajouter cette solution de lavage pour le tube à 18.B. étape

20.b. Si nécessaire, l'ADN peut être davantage concentrés par Microcon ® Ultracel YM-30 Unité de filtre centrifuge; pré-laver le filtre en ajoutant 200 ul de TE et la centrifugation à 10000 xg pendant 7 minutes. Ajouter la solution d'ADN sur le filtre et centrifuger à 5000 x g pendant 1 min. Répétez jusqu'à ce que la centrifugation quantité de solution d'ADN sur le filtre réduit à 50 pi environ.
Remarque: Le volume maximal de l'échantillon initial pour Microcon filtre est de 500 pi. Ne pas centrifuger à une vitesse supérieure à 14 000 x g. Ne pas trop centrifugeuse jusqu'à la membrane sèche complètement. Assurez-vous que certains liquides couvre encore le filtre après centrifugation. Si vous plus centrifugé et la membrane est sèche, puis ajouter 15 ul de TE, agiter doucement pendant 30 secondes, et passez à l'étape 21.b.

21.b. Placez l'unité de filtre à l'envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 xg pendant 3 minutes pour récupérer les ADN.

22. Quantifier l'ADN du gel par TAE (0,8%, 0.5xTAE, 50 V pour 4 heures), et par spectrophotomètre Nanodrop ou Pico-vert dosage et lecteur de plaque.
Nota: Un montant ADN peut être estimée en comparant la bande de l'échantillon à la bande de marqueur à la concentration connue (Haute marqueur d'ADN moléculaire ou λHindIII) sur le gel.

23. Vérifier l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire en utilisant électrophorèse en champ pulsé (PFGE) avec 1%, 1xTAE gel (Pour plus de détails, voir l'Étape II, part2 au https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 par Taupp et al 2009)..
Note: Vous pouvez utiliser régulièrement un gel d'agarose à cet effet QC lieu de basse température de fusion d'agarose. En bref, électrophorèseconditions résistance sont comme suit: 2-250 ko, 6 volts, initiales temps de commutation: 5 sec, temps final de commutation: 15 sec, une durée de 12 heures à 14 ° C. SYBR Gold coloration pendant une heure pour visualiser l'ADN sur le gel.

24. Si le poids moléculaire de l'ADN extrait sont satisfaisants, puis passez à l'étape suivante de centrifugation en gradient de CsCl. Alternativement, l'ADN peut être conservé à -20 ° C ou -80 ° C avant la centrifugeuse CsCl.
La taille médiane de l'ADN devrait être l'égal ou supérieur à 36 Ko, si vous voulez construire une bibliothèque d'insérer grande métagénomique ADN.

Partie II. Purification d'ADN à l'aide de césium ultracentrifugation en gradient de chlorure de

Préparation de la centrifugeuse: 1,5 - 2 heures
Étape de centrifugation: 18 heures
Retrait de bromure d'éthidium (BET) et concentre l'ADN après centrifugation: 3 heures

Procédure

Pour plus de détails, reportez-Wright et al. . 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352

Résultats Représentant / résultat

Le montant total de l'ADN génomique isolé à partir de 2 g de forêt organique du sol (O horizon) et horizons minéraux (Ae, AB et Bt horizons) (échantillon de la productivité des sols à long terme (LTSP) site situé à Skulow lac, BC, Canada et gérés par BC Ministry of Forests and Range) variait de 10 mg à 180 mg. La taille médiane de l'ADN isolé a été généralement entre 40 - 60 Ko (figure 1). Le rapport de l'absorbance à 260 nm a été nm/280 entre 1.3 à 1.6 et il y avait un pic à 230 nm, ce qui peut indiquer une contamination acide humique souvent observé dans les échantillons de sol. La centrifugation en gradient de CsCl considérablement réduit cette contamination et a également augmenté le ratio de 260 / 280-1.8 - 1.9 Comme le montre la figure 2a et 2b.

Figure 1. ECP photos de l'ADN génomique extrait avant ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 ko marqueur de 100 ng, piste 2: λHind III marqueur de 100 ng, piste 3: λHind III marqueur de 250 ng, piste 4: λHind III marqueur de 500 ng, lane5: fosmide 36 ko marqueur de 100 ng, voies 6 et 7: génomique l'ADN isolé à partir du sol minéral horizon Ae, couloir 8 et 9: l'ADN génomique isolé de l'AB horizon minéral du sol sur le site LTSP situé Skulow Lake, C.-B.

Chromograms Figure 2. De l'ADN génomique détecté par spectrophotomètre avant (A) et après ultracentrifugation CsCl (B). Notez la réduction de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde nm 230 après ultracentrifugation CsCl, ce qui indique une amélioration dans la qualité de l'ADN génomique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.