の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

Summary

我々は、固定、包埋、切片、および後期のイメージングのためのプロセスについて説明<em>ショウジョウバエ</em>胎児心臓の管のTrasmission電子顕微鏡のための胚。この手法は、心臓の管の内腔の可視化だけでなく、線心の内腔を基底膜、が可能になります。

Abstract

の形態形成<em>ショウジョウバエ</em>胎児心臓の管が胚発生時の細胞遊走、細胞間接着と細胞の形状変化を研究するための貴重なモデル系として注目されています。この構造の研究に直面する課題の1つは、心臓の管の内腔だけでなく、心臓の管の形成に重要な役割を果たす膜の機能は、全体のマウント胚で視覚化することが困難であることを心管のサイズが小さいためです。胚からの相対と内腔空間。透過型電子顕微鏡の使用は、これらの構造の高倍率を可能にし、容易に内腔の大きさと形状を明らかに断面で胚を検査できるという利点があります。このビデオでは、我々は詳細後期段階の信頼性の高い固定するためのプロセス、埋め込み、および切片を<em>ショウジョウバエ</em細胞間の接合部と基底膜を含む、心臓の管の内腔だけでなく、重要な細胞構造を視覚化するために>胚。

Protocol

新鮮な20 mlのガラス製シンチレーションバイアルに50mmのカコジル酸緩衝液（pH7.4）で12.5％のグルタルアルデヒドを含む固定液の2ミリリットルの準備。 n -ヘプタンの8ミリリットルを追加し、積極的に振る。二つの相が分離することができます。 、グルタルアルデヒドで飽和したn -ヘプタンを含む上相を削除するクリーンなシンチレーションバイアルに位置し、脇に置きます。これは、固定液になります。 取り外し可能なメッシュインサートの小さなバスケットです。胚の収集チャンバーを、使用して00〜20時間の胚を収集する。 2〜3分間、50％漂白剤溶液に胚を浸漬して外側の絨毛膜を除去するか、または胚は、漂白剤の表面に浮くまで。ペーパータオルの上でddH20とブロットの胚で十分にすすいでください。 鉗子を用いて、胚がメッシュから落下するので、固定液にdechorionated胚と場所で覆われているメッシュインサートを拾う。 Nutatorに混合しながら胚は4℃で1.5時間修正することができます。 両面テープが並んでペトリ皿を準備します。パスツールピペットを用いて固定液から胚を取り出して、テープの接着剤を溶解することから、固定液にヘプタンを防ぐために、ペトリdish.Transferのテープ表面固定液の最小量の胚にそれらを置きます。胚の単層を作るためにシャーレを振る。ヘプタン蒸発するまでフードのペトリ皿を置きます。胚をカバーするのに十分なPBS + 0.1％のTween20を追加。鈍タングステン針で解剖顕微鏡下で後期ステージ16胚を手devitellinize。 1.5mlマイクロチューブにパスツールピペットで胚を回復する。手順5〜7は、このマイクロ遠心チューブで実施されています。 0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）で胚を洗い流してから0.1Mカコジル酸緩衝液、室温で1時間、pH7.4中、1％四酸化オスミウムを含む溶液中で後処理を修正。 0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）で胚を洗浄します。 エタノールとアセトンの段階的な一連の胚を脱水する。 10分間70％エタノール、続いて10分間50％エタノールで胚を脱水する。その後10分、10分ごとの2つの100％アセトンのステップについては、90％アセトンで脱水。 アセトンを削除してから1時01分エポン-スパー樹脂添加することにより浸透プロセスを開始：胚にアセトン混合物を。真空圧力下で試料を保持しながら、PelcoのBiowave Proのマイクロ波を用いて3分間電子レンジ。マイクロ波が終了した後に追加の5分間のサンプルへの真空圧力を適用する。交換1:1樹脂100％エポン-スパー樹脂や電子レンジで再び真空圧力下でアセトン混合物。真空圧力下交流100パーセントエポン-スパー樹脂最後の時間、および電子レンジ。 パスツールピペットを用いて、胚を遠心チューブから金型を埋め込むシリコンに転送されます。胚の後端は、金型のテーパーエッジで揃っているような行に胚の位置を合わせます。一晩70℃のオーブンで焼く。 サンプルを取り出して、切片の準備。 ダイヤモンドヒストグラムナイフとリッヘルトUltracut Eミクロトームを用いて1μmのセクションをカット開始。第一胚のセクションに達したときのことに注意してください。この点から、試料中に100μmのカット。ループを使用してセクションを削除し、ガラススライド上に位置。簡単に言えば、ホットプレート上でセクションを加熱する。メチレンブルーのドロップを使用してセクションを染色。光学顕微鏡下で心臓の内腔を識別する。 ダイヤモンド超45 °ナイフやリッヘルトUltracut Eミクロトームを使用して90nmプロセスのセクションをカット。銅のグリッド上で複数のセクションを拾う。 グリッドは、10分間50％エタノールで飽和3％酢酸ウラニルで染色し、蒸留水で3回洗浄されています。その後、グリッドはCO 2フリーの環境を作成するために水酸化ナトリウムのペレットを含むチャンバに2.5分間クエン酸鉛（10ミリリットル蒸留水と100ミリリットル10M NaOHに溶解0.04gms）で染色されています。グリッドは、再蒸留水で3回洗浄されています。 セクションは80KvでJEOL 1200EX電子顕微鏡で調べ、そしてAMTデジタルカメラで撮影されています。

Discussion

ショウジョウバエ胚心臓の管の形態形成は胚発生中に細胞接着と細胞の形状変化を研究するための貴重なモデル系として注目されています。この構造の研究に直面する課題の1つは、心臓の管の内腔が全体のマウント胚で視覚化することが困難であるということです。前述の手順^1〜2から適応されたこのビデオで示される技術は、効率的かつ確実に心臓の管および管腔形成³の遺伝子型のかなりの数を分析することで成功するために証明されている。