電位感受性色素を用いてモルモット腸ネットワークにおける電気活動の光学的記録
Summary
電位感受性色素は、その単一細胞から複数の神経節の回路への範囲は調整可能な解像度と、そのようなモルモット腸神経系の神経叢としてそのままニューラルネットワークからの電気活動の光学的記録を有効にする方法このプロトコルは示しています。
Abstract
腸神経系（ENSは）分離して複雑な動作を行うことのできる識別機能を持つ自己完結型のネットワークです。その神経細胞（直径10〜25μmであるが）腸壁の異なる平面に限定されている神経叢に配置されています<sup> 1</sup>、筋層間神経叢は、縦と円形の筋層、及び円形の筋層と粘膜との間の粘膜下神経叢との間で見つけることができます。これらの神経叢（上皮、内分泌細胞、免疫要素、血管や平滑筋の輸送）のためのエフェクターシステムはまた、腸壁内に含まれているので、半無傷の調製物は、異なる反射経路の個々のコンポーネントを保持することを解剖することができます。エフェクターシステムの動作は、コンサートで行動する粘膜下と筋層間神経叢によって制御されます。したがって、神経節内との間に、と神経叢の間の通信のシナプスの相互作用の詳細な知識は、正常な胃腸機能を理解するために不可欠です。 ENSは、無傷の神経系として、1つは神経回路網とその生理的な出力の電気的挙動を分子や細胞のイベントを関連付けることのできるユニークな実験的なモデルです。ため、その神経叢の準2次元組織から、ENSは、特によく電位感受性色素を採用し、複数のサイト光記録技術を用いたニューラルネットワークの学習に適しています<sup> 2,7,8,9</sup>。我々はここでは比較的新しいnaphthylstyryl – ピリジニウム染料（ジ-4 – ANEPPDHQ）の使用を説明します<sup> 3</sup>非常に低い光毒性、内在化の速度が遅い、と顕著な化学的安定性を含む、その前任者以上の複数の利点を、提供している。サブミリ秒の時間分解能を可能にするカメラと組み合わせて使用すると、この色素は、私たちは、100Xの倍率で〜2.5μmの最大限の空間分解能と視野内のすべてのニューロンの電気的活動を監視することができます。低倍率（10倍または20倍）で、単一セルの分解能の犠牲は間神経節回路の複雑さを明らかに、視点の利得によって補償されます。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、二つの目標を念頭に書かれています。最初のものは、過去10年間の多くの技術的進歩、電位感受性色素を用いて電気的活性の光記録のおかげで無傷の神経ネットワークを研究するための最も強力な、信頼性と手頃な方法論の一つとなっている、という他の研究者を説得することです。確かに、それは簡単に控えめなリソースを持つ実験室でも実装することができます。第?…
Acknowledgements
私達は私達が私たちと彼の技術的な専門知識を共有するための2光子ビデオの冒頭に示されている画像、およびH.高野を取得するために彼の2光子顕微鏡を使用できるようにするためのDAコールターを（CHOP）に感謝いたします。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
References
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
