מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching
Summary
במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.
Abstract
Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching היא טכניקה מיקרוסקופיה למדידת מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) של מקרומולקולות, והוא יכול להיות מיושם גם<em> במבחנה</em> ו<em> In vivo</em> מערכות ביולוגיות. Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching מבוצע על ידי photobleaching אזור של אינטרס בתוך מדגם ניאון באמצעות הבזק לייזר אינטנסיבי, ולאחר מכן משפשפים את הקורה ואת ניטור הקרינה כפי עדיין פלורסנט מולקולות מחוץ לאזור של מפוזר עניין להחליף את מולקולות photobleached . נתחיל ההפגנה שלנו על ידי יישור קרן לייזר דרך התא Pockels (לייזר אפנן) ו לאורך השביל אופטי באמצעות תיבת לייזר לסרוק העדשה אובייקטיבי המדגם. לשם הפשטות, נשתמש דגימה של צבע פלואורסצנטי מימית. לאחר מכן, לקבוע את הפרמטרים של הניסוי מתאים המדגם שלנו כולל, לפקח סמכויות הלבנה, משך אקונומיקה, רוחב סל (עבור ספירת פוטון), וזמן ההתאוששות פלואורסצנטי. לאחר מכן, נתאר את הליך נטילת עקומות התאוששות, תהליך זה יכול להיות אוטומטי במידה רבה את התפוקה משופר באמצעות LabVIEW (National Instruments, אוסטין, טקסס). לבסוף, מקדם הדיפוזיה נקבעת על ידי מתאים לשחזור נתונים למודל המתמטי המתאים באמצעות אלגוריתם הפחות ריבועים הולם, לתכנות בקלות באמצעות תוכנות כגון MATLAB (Mathworks, Natick, MA).
Protocol
Discussion
כוחה של התאוששות רב פוטון הקרינה לאחר photobleaching טמון ביכולתה לחקור דגימות עבה עם רזולוציה 3D. מאז הפיתוח שלה של 1990, MP-FRAP נעשה שימוש כדי לקבוע את מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) בגוף התא, לשעבר פרוסות vivo רקמה עבה, ברקמות interstitium vivo ו. במאמר זה, הצגנו…
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מחלקת הביטחון של עידן פרס המלומד התקווה (מס 'W81XWH-05-0396) וכן חוקר Pew פרס למדעי ביו אדוארד בראון ב III.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
