Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정
Summary
이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.
Abstract
photobleaching 후 다중 형광 복구 macromolecules의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)을 측정하는 데 사용되는 현미경 기술이며, 모두에 적용할 수있는<em> 체외에서</em>과<em> 생체내에</em> 생물 학적 시스템. photobleaching 후 다중 형광 복구 후 빔을 attenuating하고 photobleached 분자를 교체에 관심 확산의 영역 밖에서 아직도 형광 분자로 형광을 모니터링, 강렬한 레이저 플래시를 사용하여 형광 샘플 내에서 관심 영역을 photobleaching에 의해 수행됩니다 . 우리는 Pockels 전지 (레이저 변조기)를 통해 및 샘플에 레이저 스캔 상자와 객관적인 렌즈를 통해 광학 경로를 따라 레이저 빔을 정렬하여 데모를 시작합니다. 단순화하기 위해, 우리는 수성 형광 염료의 샘플을 사용합니다. 그런 다음 적절한 실험을 포함하여 샘플에 대한 매개 변수를 모니터와 표백 능력, 표백 기간, 빈 너비 (광자 집계) 및 형광 복구 시간을 결정합니다. 다음, 우리는 복구 곡선, 크게 향상된 처리량을위한 LabVIEW (내쇼날 인 스트 루먼트, 오스틴, TX)를 통해 자동으로 사용할 수있는 프로세스를 주셔서 절차를 설명합니다. 마지막으로, 확산 계수는 같은 MATLAB (Mathworks, 내틱, MA)와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽게 프로그래밍 최소 제곱 피팅 알고리즘을 사용하여 적절한 수학적 모델 복구 데이터를 피팅에 의해 결정됩니다.
Protocol
Discussion
photobleaching 후 다중 광자 형광 회복의 능력은 3D 해상도 두꺼운 샘플을 탐사하는 기능에있다. 1990 년대에 개발 이후, MP – FRAP은 세포 기관, 전직 생체내 두꺼운 조직 슬라이스하고, 생체내 조직과 interstitium에의 확산 계수 (또는 유사한 전송 매개 변수)를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 실험 매개 변수를 설정 데이터를 복용하고, 복구 곡선을 분석, MP – FRAP 실…
Acknowledgements
이 작품은 호프 학술 상 국방 시대의학과 (제 W81XWH – 05-0396)과 에드워드 B. 브라운 III에 의생명 과학 수상의 퓨 학술 의해 투자되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
