Photobleaching के बाद दो photon प्रतिदीप्ति वसूली के माध्यम से प्रसार Coefficients माप
Summary
इस अनुच्छेद में हम प्रसार बहु photon प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching का उपयोग गुणांकों को मापने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करेंगे. हम नमूना करने के लिए ऑप्टिकल पथ के साथ लेजर aligning और उचित प्रयोगात्मक मापदंडों का निर्धारण शुरू हो जाएगा, तब पैदा जारी रखने और अंत में फिटिंग प्रतिदीप्ति वसूली घटता.
Abstract
Photobleaching के बाद मल्टी प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक अणुओं की प्रसार गुणांक (या अनुरूप परिवहन पैरामीटर) को मापने के लिए इस्तेमाल किया है, और दोनों के लिए लागू किया जा सकता है<em> इन विट्रो में</em> और<em> Vivo में</em> जैविक प्रणालियों. Photobleaching के बाद मल्टी प्रतिदीप्ति वसूली एक फ्लोरोसेंट नमूना के भीतर एक तीव्र लेजर फ्लैश का उपयोग ब्याज की एक क्षेत्र photobleaching द्वारा किया जाता है, तो बीम attenuating और अभी भी हित में फैलाना के क्षेत्र के बाहर से फ्लोरोसेंट अणु के रूप में प्रतिदीप्ति photobleached अणुओं की जगह की निगरानी . हम Pockels सेल (लेजर न्यूनाधिक) के माध्यम से और लेजर स्कैन बॉक्स और नमूना उद्देश्य लेंस के माध्यम से ऑप्टिकल पथ के साथ लेजर बीम aligning से हमारे प्रदर्शन शुरू हो जाएगा. सादगी के लिए, हम जलीय फ्लोरोसेंट रंजक का एक नमूना का प्रयोग करेंगे. हम तो सहित उचित प्रयोगात्मक हमारे नमूना के लिए मानकों, निगरानी और शक्तियों विरंजन, ब्लीच अवधि, बिन चौड़ाई (फोटॉन गिनती के लिए), और प्रतिदीप्ति वसूली समय का निर्धारण करेगा. अगला, हम वसूली घटता, एक प्रक्रिया है कि काफी हद तक बढ़ाया throughput के लिए LabVIEW (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स, ऑस्टिन, TX) के माध्यम से स्वचालित किया जा सकता है लेने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करेंगे. अंत में, प्रसार गुणांक उचित गणितीय मॉडल एक फिटिंग कम से कम वर्गों एल्गोरिथ्म, आसानी से प्रोग्राम MATLAB (Mathworks, Natick, एमए) जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए वसूली डेटा फिटिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है.
Protocol
Discussion
बहु फोटॉन photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली की शक्ति इसके लिए 3 डी संकल्प के साथ मोटी नमूनों की जांच करने की क्षमता में निहित है. 1990 में इसके विकास के बाद से, सांसद FRAP सेल निकायों, पूर्व vivo मोटी ऊतक स्लाइस, ?…
Acknowledgements
यह काम आशा है कि विद्वान पुरस्कार के रक्षा काल का एक विभाग (सं W81XWH-05-+०,३९६) और बायोमेडिकल साइंसेज एडवर्ड बी ब्राउन III के लिए पुरस्कार में एक बेंच विद्वान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
