Mätning Diffusion Koefficienter via två-photon fluorescens återhämtning efter fotoblekning
Summary
I denna artikel kommer vi att beskriva förfarandet för mätning diffusion koefficienter med hjälp av flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning. Vi börjar med att rikta lasern längs den optiska väglängden till provet och fastställande av lämplig experimentella parametrar, då fortsätta att generera och slutligen montering fluorescens kurvor återhämtning.
Abstract
Multi-fluorescens återhämtning efter fotoblekning är en mikroskopi teknik som används för att mäta diffusionskoefficient (eller motsvarande transport parametrar) av makromolekyler, och kan tillämpas på både<em> In vitro</em> Och<em> In vivo</em> Biologiska system. Multi-fluorescens återhämtning efter fotoblekning utförs av fotoblekning en region av intresse inom ett fluorescerande prov med hjälp av en intensiv laser blixt, sedan dämpa balken och övervakning av den fluorescens som alltjämt fluorescerande molekyler från utanför regionen av intresse diffusa att ersätta photobleached molekylerna . Vi börjar vår demonstration genom att rikta laserstrålen genom Pockelscell (laser-modulator) och längs den optiska vägen genom Laser Scan rutan och objektiv till provet. För enkelhetens skull kommer vi att använda ett urval av vattenbaserade fluorescerande färg. Vi kommer då att bestämma lämplig experimentella parametrar för vårt urval, inklusive, övervaka och blekning befogenheter, blekmedel längd, bredd bin (för foton räkna) och fluorescens återhämtningstid. Därefter kommer vi att beskriva förfarandet vid återhämtning kurvor, en process som kan till stor del automatiserad via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) för ökad genomströmning. Slutligen är diffusion koefficient bestämd av montering återhämtningen data till lämpliga matematiska modellen med minsta-kvadrat passande algoritm, lätt programmerbar med hjälp av programvara såsom Matlab (The MathWorks, Natick, MA).
Protocol
Discussion
Kraften i flera foton fluorescens återhämtning efter fotoblekning ligger i dess förmåga att söka tjocka prover med 3D-upplösning. Sedan dess utveckling under 1990-talet, har MP-FRAP använts för att bestämma diffusionskoefficient (eller liknande transporter parametrar) i cell organ, ex vivo tjocka skivor vävnad och in vivo vävnad och interstitium. I denna artikel presenterade vi den utrustning som krävs för att köra en MP-FRAP experiment, liksom korrekt förfarande för anpassning av strå…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av ett försvarsdepartementet era av hopp Scholar Award (nr W81XWH-05-0396) och en Pew Scholar i biomedicin Award till Edward B. Brown III.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ti:sapphire laser | Spectra Physics | Mai Tai | ||
| Pockels Cell | Conoptics | 350-80 | ||
| Laser Scanning Microscope | Olympus | Fluoview | ||
| Short pass dichroic mirror | Chroma Technologies | 670 DCSX-2P | ||
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | ||
| Photon counter | Stanford Research Systems | SR 400 | ||
| Multi-channel scaler/averager | Stanford Research Systems | SR 430 | ||
| Pulse Generator | Stanford Research Systems | DG 535 | ||
| FITC-BSA | Invitrogen | — |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
- Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).
- Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. r. o. w. n., Jr, E. B., Brown, E. B. Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo. Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).
