डि-8-ANEPPS के साथ प्रेरित झिल्ली वोल्ट माप
Summary
बाहरी बिजली के क्षेत्र एक सेल की झिल्ली पर एक वोल्टेज लाती है, प्रेरित झिल्ली वोल्टेज (ΔΦ) करार दिया. Potentiometric di-8-ANEPPS डाई का उपयोग करके, यह संभव है ΔΦ noninvasively उपाय. इस वीडियो को मापने के लिए प्रोटोकॉल पता चलता है ΔΦ di-8-ANEPPS का उपयोग.
Abstract
एक बाहरी बिजली के क्षेत्र में एक सेल की नियुक्ति एक स्थानीय प्रभारी पुनर्वितरण के अंदर और कोशिका झिल्ली के आसपास के क्षेत्र में सेल के बाहर का कारण बनता है, झिल्ली भर में वोल्टेज में जिसके परिणामस्वरूप. इस वोल्टेज, झिल्ली वोल्टेज प्रेरित करार दिया (transmembrane भी प्रेरित वोल्टेज, या प्रेरित transmembrane क्षमता अंतर) और ΔΦ से चिह्नित ही मौजूद है के रूप में लंबे समय के रूप में बाहरी क्षेत्र मौजूद है. यदि आराम वोल्टेज झिल्ली पर मौजूद है, प्रेरित वोल्टेज पर superimposes (कहते हैं). Di-8-ANEPPS जैसे potentiometric फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग करके, यह संभव है कोशिका झिल्ली पर ΔΦ के रूपांतरों निरीक्षण और noninvasively इसकी कीमत को मापने. di-8-ANEPPS जोरदार फ्लोरोसेंट हो जाता है जब प्रतिदीप्ति ΔΦ के परिवर्तन करने के लिए आनुपातिक तीव्रता के परिवर्तन के साथ कोशिका झिल्ली के लिपिड bilayer बाध्य. इस वीडियो को मापने के लिए प्रोटोकॉल ΔΦ di-8-ANEPPS का उपयोग कर दिखाता है और भी आयाम और ΔΦ के स्थानिक वितरण पर कक्ष आकार के प्रभाव को दर्शाता है.
Protocol
Discussion
प्रेरित transmembrane () झिल्ली वोल्टेज, ΔΦ, माप वोल्टेज gated झिल्ली चैनलों, कार्रवाई संभावित प्रसार, हृदय सेल उत्तेजना, या कोशिका झिल्ली [3 electroporation, 4, 5, 6 के अध्ययन के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग में महत्वपूर्ण हो सकता है , 7]. सरल सेल आकार के साथ, ΔΦ विश्लेषणात्मक गणना की जा सकती है. उदाहरण के लिए, एक गोलाकार सेल के लिए, ΔΦ Schwan s समीकरण है, जिसमें कहा गया है कि वोल्टेज क्षेत्र शक्ति और सेल आकार करने के लिए आनुपातिक है और झिल्ली के साथ कोसाइन समारोह के बाद के द्वारा दिया जाता है [8, 9]. ΔΦ अधिक जटिल सेल आकृतियों के लिए, काफी कोज्या से विचलित और या तो संख्यानुसार निर्धारित किया जाना चाहिए, एक कंप्यूटर [2, 10, 11], या प्रयोगात्मक का उपयोग करते हुए, एक potentiometric [12, 13, 14, 15] डाई का उपयोग कर सकते हैं.
Potentiometric व्यापक रूप से इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल रंगों di-8-ANEPPS (di-8-butyl – एमिनो naphthyl pyridinium – propyl sulfonate ethylene), उत्तेजना और उत्सर्जन झिल्ली वोल्टेज पर निर्भर स्पेक्ट्रा के साथ एक तेजी से डाई, जो कोशिका झिल्ली पर है और इसकी कीमत को मापने ΔΦ के रूपांतरों के noninvasive टिप्पणियों अनुमति देता है. इस वीडियो में, हम di-8-ANEPPS का उपयोग करके एक ΔΦ के निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण दिखा.
डाई प्रोफेसर लेस्ली Loew और [13, 14] उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय में तेजी से प्रतिक्रिया रंगों के वर्ग के अंतर्गत आता है है. di-8-ANEPPS पानी में nonfluorescent है और दृढ़ता फ्लोरोसेंट जब यह कोशिका झिल्ली के लिपिड bilayer में शामिल हो जाता है. Intramolecular प्रभारी वितरण और वर्णक्रमीय और डाई प्रतिदीप्ति का प्रोफ़ाइल तीव्रता में इसी बदलाव का एक परिवर्तन में ΔΦ परिणाम में बदल जाते हैं. di-8-ANEPPS प्रतिदीप्ति तीव्रता ΔΦ के बदलने के लिए आनुपातिक होता है; डाई की प्रतिक्रिया -280 एम वी से 250 को लेकर mV [4, 16] voltages के लिए रेखीय है. डाई, असमान झिल्ली धुंधला के प्रतिदीप्ति में अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तन, और डाई internalization di-8-ANEPPS कम झिल्ली वोल्टेज, अपने आराम घटक जैसे की निरपेक्ष माप के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, हालांकि इस तरह के प्रयासों को भी [17] सूचित किया गया. यह है, तथापि, जैसे nonexcitable बाहरी बिजली क्षेत्रों को उजागर कोशिकाओं में प्रेरित झिल्ली वोल्टेज की शुरुआत [12, 13], या कार्रवाई क्षमता उत्तेजनीय [4, 5] कोशिकाओं में झिल्ली वोल्टेज में बड़ा परिवर्तन, को मापने के लिए उपयुक्त है. हालांकि यहाँ लागू नहीं, Di-8-ANEPPS भी अनुमति देता है प्रतिदीप्ति उत्तेजना के ratiometric माप द्वारा ΔΦ के दृढ़ संकल्प [18] या उत्सर्जन [19] है, जो प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता बढ़ जाती है और abovementioned प्रभाव को कम कर देता है. Di-8-ANEPPS झिल्ली दाग के रूप में, यह भी एक झिल्ली मार्कर के रूप में स्पष्ट रूप से कर सकते हैं इस्तेमाल किया जा [2].
डाई की कमियां की है कि यह photobleaching करने के लिए प्रवण है, इसलिए है कि मजबूत प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचा जाना चाहिए. डाई के अंशांकन या तो (i) के पोटेशियम ionophore और बाहरी माध्यम से विभिन्न पोटेशियम सांद्रता का एक सेट valinomycin के साथ किया जाता है [2,18], या (ii) पैच दबाना वोल्टेज क्लैंप मोड में [17]
अंत में, गोलाकार कोशिकाओं और अधिक जटिल आकार की कोशिकाओं पर ΔΦ की माप के साथ, वीडियो ΔΦ के आयाम और स्थानिक वितरण पर कक्ष आकार के प्रभाव को दर्शाता है. इस प्रकार गोलाकार कोशिकाओं के लिए ΔΦ एक कोज्या के लिए करीब है, Schwan समीकरण के साथ समझौते में, जबकि अधिक जटिल सेल आकृतियों के लिए ΔΦ के स्थानिक वितरण और अधिक जटिल है [20] …
Acknowledgements
यह काम Z2-9229 परियोजना और P2 0,249 कार्यक्रम के साथ स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी के द्वारा समर्थित किया गया था. इस वीडियो "electroporation आधारित टेक्नोलॉजीज और" वैज्ञानिक कार्यशाला और स्नातकोत्तर कोर्स, इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय द्वारा biannually Ljubljana, स्लोवेनिया विश्वविद्यालय में आयोजित उपचार के लिए पूरक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
| microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
| electrodes | Custom made | Pt/Ir |
References
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