Summary
Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.
Abstract
Colocação de uma célula em um campo elétrico externo causa uma redistribuição no interior locais de carga e fora da célula nas proximidades da membrana celular, resultando em uma tensão através da membrana. Esta tensão, denominado tensão de membrana induzida (tensão induzida transmembrana também, ou diferença de potencial transmembrana induzido) e denotado por ΔΦ, existe apenas enquanto o campo externo está presente. Se a tensão de repouso está presente na membrana, a tensão induzida sobrepõe (adiciona) para ele. Usando um dos corantes fluorescentes potenciométrica, como di-8-ANEPPS, é possível observar as variações de ΔΦ na membrana celular e medir o seu valor de forma não invasiva. di-8-ANEPPS torna-se fortemente fluorescente quando vinculado à bicamada lipídica da membrana celular, com a mudança da intensidade de fluorescência proporcional à mudança de ΔΦ. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS e também demonstra a influência da forma da célula sobre a amplitude ea distribuição espacial dos ΔΦ.
Protocol
Parte I: Etapas preliminares
- Neste experimento de hamster chinês linhagem de células de ovário (CHO-K1) é usado. Células são banhados em câmaras II Lab-Tek (2 poços, 4 cm 2 cada) (Nalge Nunc, Alemanha) em ~ 0.7x10 5 células / ml no HAM-F12 meio de cultura suplementado com 8% de soro fetal bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml de gentamicina (todos da Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 200 unidades / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Croácia), e incubados em 5% de CO 2 a 37 ° C. Alternativamente, as células também podem ser semeadas em # 1 entra tampa de vidro (0,13-0,16 mm de espessura), revestida com um adesivo celulares como polilisina.
- Incubar as células no seu meio de cultura. Incubação durando 2-4 rendimentos horas células que ainda estão mais ou menos esférica, mas firmemente ligada à superfície com uma pequena parte de sua membrana. Alternativamente, após 16-20 horas de incubação, as células são totalmente ligada à superfície e têm formas mais complexas, mas a maioria deles ainda não estão se dividindo.
- Prepare uma solução estoque 10 mM de di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, EUA), adicionando 843 mL de DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) a 5 mg do corante no frasco Invitrogen original. A solução de reserva podem ser armazenadas no frigorífico a 4 ° C durante vários meses. Antes de iniciar os experimentos, aquecer a solução até que os cristais de DMSO dissolver.
- Algumas linhas de celular podem exigir o uso de PLURONIC para facilitar a incorporação de corante na membrana celular. PLURONIC pode ser comprado em solução estoque de 20% em DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, EUA), ou uma solução-mãe da mesma concentração pode ser preparada dissolvendo PLURONIC em DMSO. Solução estoque de PLURONIC pode ser armazenado em temperatura ambiente.
Parte II: Carregando as células com di-8-ANEPPS
- Misture 3 mL de 10 mM di-8-ANEPPS e 2,5 mL de PLURONIC 20% em 1 ml da modificação Spinner (cálcio depleção version) do smem Médio Mínimo Essencial (médio M8167 ou M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha ) em um tubo Eppendorf 1,5 ml. Isso gera uma "solução de carga", contendo aproximadamente 30 mM di-8-ANEPPS e 0,05% de PLURONIC. Para outros tipos celulares, seus meios de comunicação cultura nativa pode ser usado em vez de smem.
- Substituir o meio de cultura na câmara Lab-Tek com a solução de carga. Transferência da câmara para a geladeira por 10 min a 4 ° C. A esta temperatura, a internalização do corante através da membrana plasmática é em grande parte inibida.
- Após a coloração, lavar cuidadosamente o excesso de corante 2-3 vezes com smem puro.
- Deixe 1,5 ml de smem na câmara.
Parte III: Experimento e de aquisição de imagem
- As células são observados usando um microscópio de fluorescência (no nosso caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Alemanha) equipado com um objetivo de imersão em óleo (X63, NA 1.4), uma VisiCam monocromador (Polychrome IV, Visitron, Alemanha) e uma câmera CCD refrigerado ( 1280, Visitron, Alemanha). As imagens são adquiridas com MetaFluor 7.1.1 e processadas em Metamorph 7.1.1 (ambos dispositivos moleculares, Downingtown, PA, EUA), mas o software de aquisição semelhante também pode ser usado. Definir o comprimento de onda de excitação no software de aquisição de 490 nm e escolha um filtro de emissão adequada para ANEPPS, por exemplo, um filtro passa-banda centrado em nm 605 (605/55m, dicróicas 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, EUA). Se um monocromador não estiver disponível, um filtro de excitação centrado em 490 nm pode ser usado em seu lugar.
- Coloque a câmara com as células para o palco microscópio, a posição dos eletrodos na parte inferior da câmara e conectá-los ao gerador de pulsos. O meio deve cobrir os eletrodos.
- Para manter a viabilidade das células e reduzir o aquecimento, o pulso deve ser de amplitude suficientemente baixa e de curta duração. Neste experimento um pulso quadrado com 35 V de amplitude e 50 ms de duração (baixa o suficiente para evitar a eletroporação) é gerada utilizando uma fonte de tensão DC e uma custom-made controlado por microprocessador dispositivo switcher. Alternativamente, um gerador de pulso comercial, tais como 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) conectado a um amplificador ou um estimulador de comerciais, como S88 (Grass, West Warwick, RI, EUA), pode ser usado. O pulso é entregue a duas paralelas eletrodos Pt / Ir fio com 0,8 mm de diâmetro e 4 mm de distância entre eles, criando um campo elétrico de aproximadamente 88 V / cm entre os eletrodos e ΔΦ indução. A distribuição exata de campo entre os eletrodos utilizados neste experimento é descrito em outros lugares [1].
- Encontrar as células de interesse. Aplicar um único pulso elétrico ou uma seqüência de pulsos. Para cada pulso, adquirir duas imagens de fluorescência: uma imediatamente antes do pulso (a imagem de controle), e uma durante o pulso (a imagem de pulso). Devido à baixa resposta de di-8-ANEPPS, as mudanças na fluorescência são difíceis de discernir a olho nu e se tornar aparente only após o processamento. A entrega de pulso deve ser sincronizada com a aquisição de imagem, que é uma característica do software de aquisição. Para evitar a fotodegradação e possível aquecimento, a iluminação pode ser limitado à duração do pulso.
Parte IV: Processamento de imagem e análise
- Abra as imagens no software Metamorph. Para cada pulso, subtrair o fundo em ambos o controle e a imagem de pulso.
- Escolha uma célula e definir a região de interesse para que ele corresponde à membrana. Medir a intensidade de fluorescência ao longo desta região na imagem e controle de pulso e transferir os valores para uma planilha.
- Para cada pulso, subtrair os dados de controle a partir dos dados de pulso, e dividir o resultado por dados de controle para obter as alterações em relação fluorescência. Se uma seqüência de pulsos é aplicada, os valores de fluorescência em relação as mudanças determinadas para cada pulso pode ser a média para obter uma medição mais confiável.
- Transformar as mudanças em relação fluorescência em ΔΦ usando uma curva de calibração. Uma estimativa grosseira da curva pode ser obtida a partir da literatura, mas para maior precisão, tem que ser medidos para cada configuração específica. Para as células e da configuração utilizados neste experimento uma diminuição de 6% na fluorescência corresponde a um aumento de 100 mV em ΔΦ [2].
- Finalmente, plotar a tensão em função do comprimento do arco relativo em um pacote de software de gráficos como o Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, EUA), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA), ou Origem (Origin Corp, Northampton, MA, EUA). A curva também pode ser suavizada com um filtro adequado, tais como o filtro de média móvel.
Discussion
Medições da membrana induzidas (transmembrana) de tensão, ΔΦ, pode ser importante em várias situações experimentais, tais como estudos de canais dependentes da voltagem da membrana, a propagação do potencial de ação, a estimulação de células cardíacas, ou eletroporação da membrana da célula [3, 4, 5, 6 , 7]. Com formas simples célula, ΔΦ pode ser calculado analiticamente. Por exemplo, para uma célula esférica, ΔΦ é dada pela equação a Schwan s, que afirma que a tensão é proporcional à intensidade do campo e do tamanho das células e segue a função cosseno ao longo da membrana [8, 9]. Para mais formas de células complicado, ΔΦ pode se desviar consideravelmente do cosseno e deve ser determinado numericamente, usando um computador [2, 10, 11], ou experimentalmente, utilizando um corante potenciométrica [12, 13, 14, 15].
Um dos corantes potenciométrica amplamente utilizado para esta finalidade é di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etileno-piridínio-propil-sulfonato), um corante rápido com espectros de excitação e emissão dependente da tensão de membrana, não-invasivo que permite observações das variações do ΔΦ na membrana celular e medir o seu valor. Neste vídeo, vamos mostrar uma abordagem experimental para a determinação de ΔΦ usando di-8-ANEPPS.
O corante foi desenvolvido pelo Professor Leslie Loew e colegas [13, 14] na Universidade de Connecticut e pertence à classe dos corantes de resposta rápida. di-8-ANEPPS é nonfluorescent em água e torna-se fortemente fluorescente quando se incorpora na bicamada lipídica da membrana celular. Uma mudança no resultado ΔΦ em uma mudança da distribuição de carga intramolecular e alterações correspondentes no perfil espectral e intensidade de fluorescência do corante. A intensidade de fluorescência de di-8-ANEPPS varia proporcionalmente à mudança de ΔΦ; a resposta do corante é linear para tensões variando de -280 mV a +250 mV [4, 16]. Mudanças relativamente pequenas na fluorescência do corante coloração da membrana, desigual, e internalização corante fazer di-8-ANEPPS menos adequado para medições absolutas de tensão de membrana, por exemplo, a sua componente de repouso, embora esses esforços também foram relatados [17]. É, no entanto, adequado para medir as mudanças maiores na tensão de membrana, tais como o início da tensão da membrana induzidas em células não excitáveis expostos a campos elétricos externos [12, 13], ou potenciais de ação em células excitáveis [4, 5]. Embora não seja aplicado aqui, di-8-ANEPPS também permite a determinação do ΔΦ por medições raciométrica de excitação de fluorescência [18] ou de emissão [19], o que aumenta a sensibilidade da resposta e reduz os efeitos acima referidos. Como di-8-ANEPPS manchas da membrana, ela também pode ser usado simplesmente como um marcador de membrana [2].
Um dos inconvenientes do corante é que ele está propenso a fotodegradação, de modo que a exposição prolongada à luz forte devem ser evitados. Calibração do corante é feita com um valinomicina ionóforo (i) de potássio e um conjunto de diferentes concentrações de potássio no meio externo [2,18], ou (ii) patch-clamp clamp no modo de tensão [17].
Finalmente, com as medidas de ΔΦ em células esféricas e células de formas mais complexas, o vídeo demonstra a influência da forma da célula sobre a distribuição espacial da amplitude e ΔΦ. Assim, para células esféricas ΔΦ está perto de uma co-seno, de acordo com a equação Schwan, enquanto para formas mais complicadas de células a distribuição espacial da ΔΦ é mais complexa [20] ...
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno com o projeto Z2-9229 e um programa de P2-0249. Este vídeo representa o material suplementar para o "Eletroporação baseado em Tecnologias e Tratamentos" workshop científico e pós-graduação, organizado a cada dois anos pela Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Ljubljana, na Eslovénia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P.
- Sersa, G., Miklavčič, D.
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
